鼠疫耶尔森氏菌VcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis)LcrV基因重组质粒pGEM－T／ypV酶切,克隆于原核表达载体pBV220,构建成pBV/ypV表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆,进行温控诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物,在相对分子质量38000处有－表达条带,经薄层扫描分析目的蛋白带占全菌蛋白的38．4％以上,主要以可溶形式存在。     

人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析

采用PCR方法,根据献报道的人成骨蛋白-1（OP-1）成熟肽基因序列,设计并合一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小的420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5k为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。     

百合查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆与分析

以东方百合“索邦”基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的目的片段克隆至pGEM-T easy载体后进行测序.结果表明,目的序列全长1 307 bp,经BLA ST分析,与鸢尾、玉米、水稻等植物的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸同源性在70%以上;与已经克隆的CHS cDNA序列相比,CHS DNA序列中包含2个外显子和1个内含子,内含子全长82 bp,符合TG-AG特征.将得到的序列提交G enB ank,序列号为DQ 471951.     

A型肉毒毒素轻链基因的克隆及其结构分析

以献报道的A型肉毒毒素基因全序列为标准,设计并合成一对引物,自肉毒梭菌基因组中扩增出肉毒毒素轻链基因片段,并将扩增产物与pGEM—T载体在体外连接,构建测序重组质粒,进行测序和基因结构分析。PCR扩增获得了产物为1 364bp的DNA片段,测序结果与DNA数据库对照检索分析证明,此基因片段与GenBank中的A型肉毒毒素LC基因的一致性达99．9％以上,可以认为克隆的基因为A型肉毒毒素LC基因。     

乙肝病毒突变核心蛋白基因的克隆及序列分析

目的克隆发生长片段缺失的乙肝病毒核心蛋白基因（HBV-C）,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法通过PCR从1株乙型肝炎病毒中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,利用TA克隆将PCR产物克隆人pUCm—T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果PCR扩增出的HBV-C基因经序列分析表明长度为454bp,其核苷酸序列缺失了220—317bp之间的98个碱基,造成从74个氨基酸起发生移码突变。结论成功克隆发生长片段缺失的HBV-C基因,为表达及功能研究奠定了基础。     

人神经生长因子基因的克隆及序列分析

以人基因组DNA为模板,采用PCR获得人神经生长因子(hNGF)基因,载体pGEM-T中,DNA序列分析克隆的hNGF基因与文献报道的完全一致。     

胁迫诱导型启动子rd29A的克隆及其序列分析

采用CTAB法提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片总DNA,设计并合成一对引物,通过PCR扩增得到一特异片段,并连接至pGEM-T Easy Vector上进行克隆测序.结果表明该片段全长为744 bp,与报道序列(AY973635)存在三个碱基的差异,同源性达99.6%;且该片段含有1个TATA box(TATAAA)、1个CAAT box(GCCAAT)、4个干旱、高盐和低温响应DRE(dehydraton responsive element binding protein)顺式作用元件(核心序列为CCGAC),从而为后期胁迫诱导型植物表达载体的构建及遗传转化奠定了基础.     

肺炎克氏杆菌GDHt-γ亚基基因克隆与序列分析

目的：克隆编码肺炎克氏杆菌GDHt-γ亚基的基因并对其进行序列分析。方法：用酚氯仿抽提法提取肺炎克氏杆菌基因组DNA,用P1、P2为引物,PCR扩增GDHt-γ亚基基因,并对目的基因进行了测序并应用生物信息学进行序列分析。结果：PCR扩增出约426bp的目的DNA片段,与GenBank中报道的K．pneumoniae GDHt-γ亚基基因序列存在一个同义突变差异（Gin：CAG→CAA）。结论：成功地获得编码GDHt-γ亚基的基因,为进一步研究该亚基的结构与生物学功能奠定了基础。     

杧果LEAFY同源基因的分离及序列分析

分析在植物开花过程中起重要作用的LEAFY(LFY)基因的保守区序列,设计1对长度均为23bp的PCR引物,以杧果基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为822bp的DNA片段,克隆入pGEM-T Easy载体。测序和序列分析表明,获得了杧果LFY同源基因(miLFY)3’端的1个片段,该片段有1个415bp的内含子,编码区共编码135个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号AY189684)。在GenBank中进行同源性检索,发现其氨基酸序列与其它植物LFY同源基因的氨基酸序列同源性高达74%~97%,推测它们具有相似的功能。     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒 (BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段 ,经pGEM T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因 2 379bp长的核苷酸序列 ,推导出 793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示 ,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高 ,达 57% ;与OpMNPV的同源性最低 ,为 39.6 %。     

人Ⅱ型囊泡单胺转运体基因的克隆

目的 为获得人Ⅱ型囊泡单胞转运体（vesicular monomine transporter-2VMAT2)以治疗帕金森病,克隆添加Kozak序列的VMAT2cDNA,用于真核细胞表达。方法 从人胎脑中提取总RNA,逆转录成cDNA,设计一对引物用PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重级一起pGEM-Easy-T载体中,酶切鉴定插入片段后,进行全序列测定。结果 RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。结论 克隆人VMAT2cDNA片断,可用于真核细胞表达。     

脂蛋白脂酶基因的克隆、序列测定及定点突变

 以人的脂肪组织总RNA为模板 ,参考已报道的脂蛋白脂酶 (lipoproteinlipase ,LPL)cDNA设计引物 ,利用RT PCR方法扩增得到了LPLcDNA ,并经序列测定证实其序列是正确的 .在冠心病患者LPL基因第 5外显子的 830位碱基处发现了G→A的转换 ,该变异导致LPL基因第 192位的密码子CGA被CAA取代 ,使LPL第 192位精氨酸改变为谷氨酰胺 .在变异碱基附近设计合成两条引物 ,其中一条包含所要改变的碱基 ,利用基于PCR的定点突变技术和体外重组的方法获得了G830A变异的LPLcDNA     

长春花黄化植原体核糖体蛋白基因片段序列分析*

对自然表现典型黄化症的长春花植株总RNA进行植原体核糖体蛋白基因（ribosomal protein gene,rp gene）PCR扩增,得到约1.3kb的特异片段。将此特异片段与pGEM-T Easy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定、限制性内切酶(EcoRI)酶切分析、核苷酸序列测定及分析,结果表明该株系核糖体蛋白基因片段长1,44bp,包含rp122、rps3基因,分别编码129和252个氨基酸,且这两个基因为重叠基因。该植原体核糖体蛋白基因特性与其它植原体相似。     

大肠杆菌ubiA基因的克隆及序列测定

以E.coli JM83染色体DNA为模板PCR扩增ubiA的结构基因,将PCR产物克隆于pUCm-T Vector,对PCR产物进行测序鉴定。与已发表的大肠杆菌ubiA基因序列比较,同源性达99％。     

丙型肝炎病毒北京株NS3基因的克隆及测序

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从北京株丙型肝炎病毒中扩增出ＮＳ３区基因片段,该片段经ｐＧＥＸ－Ｔ载体克隆到大肠杆菌ＤＨ５α菌株中．经自动序列分析仪测出ＮＳ３基因的７２８ｂｐ长的核酸序列．发现在该片段中第３１位核苷酸发生Ａ→Ｔ突变,产生一个终止突变．这表明,丙型肝炎病毒北京株存在一定的变异,产生缺陷型病毒,这类缺陷型病毒的出现可能是丙型肝炎病毒持续性感染的原因之一．     

人TRAIL基因cDNA的克隆及其在COS—7细胞中的表达

ＴＲＡＩＬ(ＴＮＦｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ)是最近克隆的肿瘤坏死因子(ＴＮＦ)家族的新成员,由于它的蛋白质结构和生物学效应类似于ＦＡＳ/ＡＰＯ1Ｌ,因此,也被称为ＡＰＯ2Ｌ。在低浓度下,ＴＲＡＩＬ能迅速地诱导多种肿瘤细胞系的?..     

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

Development of a diagnostic test for Yersinia pestis by the polymerase chain reaction

A 501 bp caf1 gene fragment and a 443 bp of pla gene fragment carried by 100 kb (pFra) and 10 kb (pPst) species-specific extrachromosomal replicons, respectively, were used as targets to study the conditions under which DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR) may be applied to detect and identify Yersinia pestis DNA in cell lysates of pure cultures and biological samples. The sensitivity limit of PCR with the crude cell lysates of Y. pestis EV was estimated as 10–50 cfu in reaction mixture. When target Y. pestis EV cells were mixed with fresh blood of white mice, which contained 0.4% potassium citrate, the PCR detection level varied from 400 to 100 cfu ml^-1 of blood depending on the method used for preparing the sample. In our tests PCR was effective for the detection of yersinia in the blood of white laboratory mice experimentally infected with virulent Y. pestis KM638 strain. This method can be considered convenient for routine detection and identification of Y. pestis.