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应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。 相似文献
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【目的】创伤弧菌是致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。本研究以创伤弧菌分离来源(临床和环境)作为不同表型,通过与260株基因组序列进行关联分析,挖掘毒力相关因子,从而进一步了解创伤弧菌致病因素。【方法】对139株创伤弧菌分离株进行高通量测序,获取其全基因组序列;与公共数据库已公开发表的121株基因组整合,使用pyseer软件进行全基因组关联分析,对与不同分离来源显著相关的基因进行注释和解读。【结果】共发现11个基因与临床分离株显著相关,其中9个是本研究新发现的创伤弧菌潜在毒力相关因子。【结论】本研究使用群体基因组学和统计遗传学方法,在全基因组范围扫描挖掘了创伤弧菌毒力相关因子,为深入揭示该物种致病机制、设计新的疫苗和治疗靶点提供了重要依据。 相似文献
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以含Cbh1的pUC18-181 DNA 为模板,经PCR扩增得到带有T7启动子的Cbh1片段,随后在缺乏糖基化的兔网织红细胞裂解液中得到成功表达,表达量为21.7 μg/m l.得到的CBH Ⅰ虽未经糖基化修饰,却可水解对硝基酚-β-D-纤维二糖苷(pNPC),对pNPC的KM 和Vm ax分别为0.82m m ol/L和0.067 μm ol·m in- 1·μg- 1,但对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)无酶活力.这表明,糖基化修饰可能不影响胞外纤维素酶的活力. 相似文献
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应用xMAP液念芯片多重快速检测四种病原微生物的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。 相似文献
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目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。 相似文献
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目的:制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRH Ⅰ)为导向部分,以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ(PEⅡ)为转膜区,以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS,体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶(rEK)切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa、A549、HepG-2、SP2/0和鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外细胞毒作用。结果:成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为94%。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa、A549、HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,而对CEF无作用。结论:重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。 相似文献
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重要生物恐怖病原及其医学防护对策 总被引:5,自引:0,他引:5
生物恐怖问题由来已久,但直到美国“9.11”事件后的炭疽芽孢袭击才引起人们广泛关注。生物恐怖已成为21世纪全人类的威胁,防范生物恐怖病原袭击已成为各国政府的当务之急。本文主要介绍了对生物恐怖的定义、生物恐怖病原种类和致病特征,以及医学防护对策。 相似文献
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应用 PCR技术 ,分别扩增拟康氏木霉 (T.pseudokoningii S38)和微紫青霉 (P.janthinellumAs3.51 0 ) Cbh1启动子的 2 84bp和 2 1 5bp两个片段 ,并通过凝胶阻滞试验 ,初步分析了在槐糖和葡萄糖两种培养条件下 Cbh1启动子上参与 Cbh1基因表达的调控信息 .凝胶阻滞试验结果表明 ,S38Cbh1启动子片段与葡萄糖和槐糖培养 /诱导条件下的无细胞提取物 ,均形成了蛋白质 - DNA复合物 ,而 As3.51 0 ,只有葡萄糖培养条件下的无细胞提取物与其启动子片段 ,形成了蛋白质 -DNA复合物 .表明在 S38Cbh1启动子的 - 30 2 /- 1 8bp处 ,可能存在与槐糖和葡萄糖介导的调控蛋白相互作用的特定核酸基元 ,而在 As3.51 0 Cbh1启动子上的 - 2 80 /- 65bp处有与葡萄糖介导的阻遏蛋白相互作用的特定核酸基元 .竞争性阻滞试验结果表明 ,S38和 As3.51 0 Cbh1启动子片段与胞内调控蛋白的相互作用是特异性的 . 相似文献