乙肝病毒突变核心蛋白基因的克隆及序列分析

目的克隆发生长片段缺失的乙肝病毒核心蛋白基因（HBV-C）,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法通过PCR从1株乙型肝炎病毒中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,利用TA克隆将PCR产物克隆人pUCm—T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果PCR扩增出的HBV-C基因经序列分析表明长度为454bp,其核苷酸序列缺失了220—317bp之间的98个碱基,造成从74个氨基酸起发生移码突变。结论成功克隆发生长片段缺失的HBV-C基因,为表达及功能研究奠定了基础。     

CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对大肠埃希菌所产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）进行基因克隆和重组表达,探讨其特性。方法以产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌12号菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CTX-M-14,将其克隆入pUCm-T Vector载体后测定该核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体pET-28α,构建含CTX-M-14基因的重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定表达的酶蛋白后再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠埃希菌BL21转化pET-28a／CTX-M-14重组质粒后,ESBLs试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量大约为30KD。结论成功表达重组的CTX-M-14型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

大肠埃希菌Mn-SOD基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

目的实现Mn-SOD基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达,制备Mn-SOD的多克隆抗体。方法用PCR方法从一株野生型大肠埃希菌（E.coli）基因组中扩增Mn-SOD基因编码区．将它克隆到原核表达载体上进行大量表达和纯化,再用纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清,用Western-blot印迹实验测定抗体效果。结果SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50％;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921．77U／mg,是对照BL21的276．77倍;并制备了高效价的多克隆抗体。结论该研究成功地构建了大肠埃希菌Mn-SOD基因高效原核表达系统,所表达的Mn-SOD具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子调控条件的优化

目的 构建大肠埃希菌BL21 Mn-SOD-RFP报告基因载体,并探讨温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子的调控.方法 利用重组PCR技术,构建以Mn-SOD启动子调控的红色荧光蛋白(RFP)报告基因载体,将融合基因与T载体连接导入大肠埃希菌中,在不同温度(20、37、40和45℃)培养不同时间(13、20、30、37、44和54 h)后,利用荧光显微镜和荧光光度计观察大肠埃希菌表达RFP的情况.结果 正确构建Mn-SOD-RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致;不同温度不同时间诱导后,Mn-SOD启动子在37℃,培养30～ 37 h表达的红色荧光蛋白最多.结论 成功构建该报告基因载体,并完成温度、时间对其调控的优化,为更进一步研究其他因素对SOD基因启动子的调控机制奠定基础.     

一株高产淀粉酶的解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其产酶条件优化

目的从土壤中分离产淀粉酶相对较高的菌株,并对其产酶条件进行优化,以期获得更经济、易得的高活力淀粉酶。方法用平板稀释涂布法分别从温州及其周边地区多个淀粉含量高的土壤、污水中采集的样品中筛选产淀粉酶菌株,通过菌落形态、生理生化反应和16S rDNA序列比对对菌株进行鉴定;并从碳源、氮源、离子浓度及紫外诱变等产酶条件对高产淀粉酶菌株进行优化;利用碘-淀粉法等对粗酶液酶学性质进行初步研究。结果从采集到的26个样品中共筛选到19株酶活较高、产酶稳定的野生型菌株。其中编号为Z19的菌株酶活最高,达到351.78 U/mL。经形态和生理生化鉴定,结合16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为解淀粉芽胞杆菌。对菌株Z19的液体发酵条件研究表明,最佳条件为玉米粉1.0%,明胶1.5%,淀粉含量0.5%,NaCl 0.5%,pH7.0,发酵温度37℃,72 h,酶活达到1 360.92 U/mL;在固体培养基上,直接用麸皮,接种量为0.1%,含水量为60%,pH7.0,120 h时,酶活达到1 504.2 U/mL。其最适酶反应pH为6.5,反应温度55~60℃,底物浓度为0.5%。结论从土壤中分离得到了产淀粉酶相对较高的解淀粉芽胞杆菌Z19菌株,产酶条件适用于工业生产,具有一定的应用前景。     

龙须菜藻红蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究

目的研究藻红蛋白不同亚基对人直肠癌SW-480细胞的抑制作用。方法通过盐析和DEAE-Sepha-rose FF柱层析从龙须菜中获得高纯度藻红蛋白,然后通过脲变性、CM-Sepharose F F阳离子交换层析与透析复性,获得具活性的PE亚基,采用MTT法检测藻红蛋白亚基对SW-480细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测藻红蛋白亚基对SW-480细胞凋亡的影响。结果 PE亚基对SW-480有较强的生长抑制作用,其中以β亚基最为显著,当β亚基剂量为20μg/mL,作用时间48 h时,其对SW-480细胞的抑制率达72.64%。结论藻红蛋白及其亚基对SW-480细胞株的生长具有较强的抑制作用,β亚基效果最好,预示其具有一定的抗肿瘤潜力。