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1.
应用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa 1229基因)并将其克隆至pMDl8-T载体中。经转化、IPTG/X—gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRI/Pstl双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆。经核苷酸序列分析证实,cpa1229基因阅读开放框架由1194bp组成。经GenBank检索对照分析,cap1229基因序列与国外献报道同源性达98.3%,表明本实验所克隆的cpa1229基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因。  相似文献   
2.
以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b( )载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。  相似文献   
3.
调查了山西太原市集中供热循环水系统中主要造成管网腐蚀的有害微生物,包括粘液异养菌、 硫酸盐还原菌、铁细菌、真菌;测定了各菌群的数量分布、类型及与水温之间的关系。结果表明:在管 网供热期间,循环水中有害菌菌数普遍低于管网腐蚀的菌数指标;停止供热期间,循环水中菌数超 标,对管网造成一定的腐蚀。  相似文献   
4.
采用RT PCR方法 ,从提取的SA1 1株轮状病毒总RNA中扩增出VP7基因片段 ,进行鉴定后 ,将该片段克隆于真核表达载体pEF1 HisC dhfr,构建成重组质粒pEF1 HisC dhfr VP7,然后用质脂体法转染COS 7细胞 ,进行真核系统的表达 .获得了长 981bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知VP7序列相同 .表达后经细胞超声破碎 ,Westernblot检测表达产物 ,在相对分子质量 38× 1 0 3 处有表达条带 ,表达蛋白主要存在于上清中 .因此 ,获得了VP7基因 ,并在COS 7细胞中获得了表达 ,表达蛋白质免疫Balb c小鼠 ,获得了具有特异性结合活性的抗体  相似文献   
5.
诱导表达重组工程菌Pbv/cpa408后,将表达菌体超声破碎,上清经80%饱和硫酸铵一次沉淀,经透析,上凝胶过滤层析柱进行分离纯化,薄层凝胶扫描结果显示,纯化的蛋白纯度达95%以上;用纯化蛋白免疫昆明小鼠,以1.0MLD100腹腔进行攻击,被免疫小鼠获得了100%的保护。  相似文献   
6.
B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。  相似文献   
7.
破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
采用PCR方法.从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71.甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10%,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。  相似文献   
8.
以设计合成的A型肉毒毒素表位模拟肽为亲和靶标,对噬菌体随机肽库进行筛选,寻找能与A型肉毒毒素表位模拟肽特异结合并能拮抗毒素毒性效应的分子,通过ELISA鉴定阳性克隆,并对鉴定的阳性克隆进行特异性分析及DNA测序。氨基酸序列同源性分析发现,针对P4、P5表位模拟肽获得了两条特异的结合序列,并通过动物保护实验在噬菌体展示肽水平对特异结合分子的毒素毒性拮抗效应进行了初步研究,初步证明结合肽对A型肉毒毒素有一定的保护作用。  相似文献   
9.
本研究旨在构建肉毒毒素蛋白受体sytII N端片段的原核表达载体,并在大肠杆菌pMAL-c2x系统中表达MBP-Syt融合蛋白。根据GenBank中已报道的人syt II基因序列,截取N端氨基酸序列,依据大肠杆菌的偏爱密码子,设计引物人工合成全基因,将全长基因克隆至原核表达载体pMAL-c2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli ER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Amylose Resin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和免疫印记对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析,为进一步研究毒素与受体相互作用的机制奠定基础。  相似文献   
10.
采用表位合成多肽免疫获得编码人源抗体的基因材料,抗体轻重链可变区基因通过剪接重叠延伸(SOE)技术进行组装后,亚克隆入噬菌体粒中构建免疫库。以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体筛选结合子,ELISA鉴定,获得具有较高抗原结合力的噬菌体克隆,进行基因测序和家族定位分析。结果显示,表位合成多肽免疫,成功构建了库容大于10^8的重组抗体库。体外3轮免疫淘筛,筛选到人源A型肉毒抗毒素克隆,基因结构分析表明,其中ScFvB17全长750bp,可编码250个氨基酸残基:VH属于VH4家族,369bp,编码123个氨基酸残基;Vκ属于κ链Ⅱ家族,336bp,编码112个氨基酸残基。基因的同源分析表明,这是一株特异的单链抗体新基因。  相似文献   
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