胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子的克隆与序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠的肝脏基因组DNA,PCR扩增胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）启动子并克隆至pUC118载体。从含IGFBP-1启动子的质粒中酶切分离出IGFBP-1启动子并测序。PCR扩增出420bp的目的DNA片段,与文献报道的IGFBP-1启动子DNA大小一致。经正、反两方向序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank数据库中的IGFBP-1启动子基因序列一致。以上结果表明克隆成功了IGFBP-1启动子基因,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

肺炎克氏杆菌GDHt-γ亚基基因克隆与序列分析

目的：克隆编码肺炎克氏杆菌GDHt-γ亚基的基因并对其进行序列分析。方法：用酚氯仿抽提法提取肺炎克氏杆菌基因组DNA,用P1、P2为引物,PCR扩增GDHt-γ亚基基因,并对目的基因进行了测序并应用生物信息学进行序列分析。结果：PCR扩增出约426bp的目的DNA片段,与GenBank中报道的K．pneumoniae GDHt-γ亚基基因序列存在一个同义突变差异（Gin：CAG→CAA）。结论：成功地获得编码GDHt-γ亚基的基因,为进一步研究该亚基的结构与生物学功能奠定了基础。     

含三倍体葡萄糖反应元件的质粒的构建及序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠肝脏的基因组DNA,PCR扩增单倍体葡萄糖反应元件（glre）。分别用SacⅠ酶单酶切glre、pUC118载体后,连接、转化,PCR筛选出含三倍体glre的质粒并测序。结果PCR扩增出51bp的目的DNA片段,与文献报道的葡萄糖反应元件glre的大小一致;连接转化后,经PCR筛选出三倍体glre,序列分析显示其基因序列和Genbank数据库中的glre基因一致。以上结果表明构建成功含三倍体glre的质粒,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。     

携胰岛素调控基因系统的载体构建及鉴定

目的：构建受胰岛素、葡萄糖双向调节的胰岛索分泌调控基因的载体。方法：1．用酚氯仿抽提法提取SD大鼠肝脏基因组DNA,用P1、P2为引物。PCR扩增胰岛素生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1);2.选用pUC118作为克隆载体,用分子克隆技术亚克隆三倍体葡萄糖反应元件(GLRE)3;3,运用基因重组技术将ICFBP-1启动子定向插入(GLRE)3的下游。结果：1.PCR扩增出420bp的目的DNA片断,与文献IGFBP-1 DNA大小一致;2．重组体序列分析显示,克隆的基因序列和文献报道的(GLRE)3及IGFBP-1基因序列一致。结论：成功构建携胰岛素调控基因系统的载体pUC118(GLRE)3-IGFBP-1。为1型糖尿基因治疗的进一步实验研究奠定了基础。     

甘油脱水酶gldC基因克隆、表达与鉴定

目的：表达及纯化甘油脱水酶γ亚基蛋白。方法：使用PCR及DNA重组技术,将甘油脱水酶7亚基基因gldC重组到含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白表达载体pMAL—c2x中,在大肠杆菌中进行表达。结果：转化重组质粒pMAL/gldC的大肠杆菌经IPTG诱导,SDS—PAGE分析显示表达出的MBP—gldC融合蛋白相对分子质量约66kD,与预期大小一致,并经Western blot分析证实。用直链淀粉树脂亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论：成功地获得甘油脱水酶γ亚基融合蛋白,以便进一步研究其生物学性能。     

重组依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因表达系统构建

采用PCR方法从肺炎克雷伯氏杆菌基因组中分别扩增得到了编码依赖辅酶B12的甘油脱水酶α、β、γ三个亚基的基因gldA、gldB、gld将gldBC基因克隆至pSIM—T载体上,经测序正确后亚克隆至pGEX-4T-1载体中。将gldA进行T-A克隆后测定核苷酸序列正确,亚克隆至连有gldBC基因的pGEX-4T-1载体中。从而成功的构建了gldABC基因的同向串联原核融合表达载体pGEX—gldABC。     

氨基糖苷类抗生素JI-20A发酵过程的磷酸盐控制

磷酸盐初始浓度6.1mmol/L~9.6mmol/L有助于菌体的生长,但抑制氨基糖苷类抗生素JI-20A的合成。在产物合成期磷酸盐浓度控制在1.1mmol/L以下可提高碱性磷酸酯酶活力,降低丙酮酸浓度,促进氨基糖苷类抗生素JI-20A合成。