人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达

采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白（osteogenic protein-1,OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10％.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性.     

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。     

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)cDNA,纯化后连接人pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR Ⅰ和HindⅢ酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m。利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。以烟草(Nicotiana tabacum L.)无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg／L潮霉素(Hygromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,Western Blot结果表明已有微量BMP表达。关键词：人骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m);烟草;根癌农杆菌介导法。     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因F238,并将其克隆至大肠杆菌质粒pET22b-TrxA中,构建双顺反子表达载体p17rx-F238.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/LIPTG、30℃条件下诱导6 h,经SDS-PAGE证实蚓激酶成熟肽蛋白获得了高效表达,所表达的蛋白产物相对分子量与预期...     

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83％的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。     

SZZ—Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定

PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素(harpin)融合蛋白的1．5kb基因片段,克隆到苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)表达载体pHZB1上,并置于晶体蛋白cry1类基因的启动子下游,从而构建表达质粒pHSZH。将表达载体pHSZH电激转化晶体缺陷型的BG—CDB菌株,获得工程菌Bt-pHSZH。SDS-PAGE蛋白分析和生物测定结果显示,培养48h的Bt-pHSZH明显表达SZZ-Harpin融合蛋白,表达产物具有诱导烟草过敏反应和系统性获得抗性的功能。     

SZZ-Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定*

PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素 (harpin)融合蛋白的 1 5kb基因片段 ,克隆到苏云金杆菌 (^{Bacillusthuringiensis} ,Bt)表达载体pHZB1上 ,并置于晶体蛋白cry1类基因的启动子下游 ,从而构建表达质粒pHSZH。将表达载体pHSZH电激转化晶体缺陷型的BtK CryB菌株 ,获得工程菌Bt pHSZH。SDS PAGE蛋白分析和生物测定结果显示 ,培养 4 8h的Bt pH SZH明显表达SZZ Harpin融合蛋白 ,表达产物具有诱导烟草     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

构建单纯疱疹病毒2型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础。采用PCR扩增HSV2-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K?gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性。结果显示,获得的重组的酵母表达载体pPIC9K-gD,测序结果证实为HSV2-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量40.63kD,等电点pI为7.15,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇。成功构建了HSV2-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体。     

糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达

通过RT-PCR方法,以埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)总RNA为模板,克隆出糖化酶(glucoamylase,amyA)基因的成熟肽编码序列(1 857 bp),编码618个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出木聚糖酶(xylanaseA,xynA)基因的成熟肽编码序列(636 bp),编码211个氨基酸.通过重叠延伸PCR( SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌ALX2.在ALX2发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(10.7 U/mL)和木聚糖酶活性( 51.8 U/mL).     

血小板生成素改构体基因的克隆和序列分析

采用PCR技术,根据文献报道的鼠TPO成熟肽基因序列,设计并合成两对引物,以鼠TPO cDNA为模板,扩增获得mTPO N端153个氨基酸的478bp cDNA片段及鼠TPO全长1032bp cDNA片段,mTPO153片段与合成的碱性成纤维生长因子序列中Lys119-Lys135as的51bp肝素结合位点DNA片段连接,克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序;同时将扩增的鼠TPO全长cDNA片段克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序。证明获得鼠血小板生成素与肝素结合位点基因及鼠TPO全长基因,继之以pMAL-C2X为表达载体构建表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因,将该结构基因引入载体pPIC9K中,将重组质粒pPIC9K-Amy转化大肠杆菌DH5α细胞,测序结果表明,克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp,其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,随着诱导培养时间的增加,在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升,在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90~100℃,最适反应pH值为4.5~5.5。该酶具有非常好的温度稳定性,在100℃条件下热处理5h,仍具有60%以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。     

重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因及其在毕赤酵母中表达

利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素基因, 连接至克隆载体pGEM-T中, 转化大肠杆菌DH5a, 通过测序对其进行序列分析后, 进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN, 通过电击法转化毕赤酵母GS115, 转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经PCR、Southern blotting鉴定, 获得了重组毕赤酵母菌株; 经甲醇诱导人脂联素基因表达, Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸PCR法准确方便克隆出人脂联素基因, 在30oC, 1%甲醇诱导48 h, 人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

两株绿脓杆菌对石油污染土壤的修复作用

本文旨在研究环境条件下微生物对石油污染土壤的修复情况。从矿井周边土样定向筛选出两株绿脓杆菌,摇瓶降解实验发现,两菌混合培养10 d原油降解率达到95.67%,比单菌培养提高至少32%,即两菌对原油降解具有协同作用。根据降解实验结果制备了混合修复菌剂,并且人工构建石油污染场地,展开中试场地修复试验,模拟不同的操作条件下土壤中原油的降解情况。经60 d修复发现,添加了菌剂的场地,石油烃含量下降趋势明显,每克土壤中石油烃含量从初始的0.8%降至0.1%–0.3%,其中额外添加有机肥作为补充碳氮源的场地,总石油烃降解率最高,达到85.28%。而未添加菌剂的对照组石油烃含量仅减少25.85%。     

黑曲霉N-2植酸酶phy4基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建

根据已发表的植酸酶phyA基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以黑曲霉N-2总DNA为模板,扩增出不包含假定信号肽序列的phyA基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为1350bp,与已发表的黑曲霉NRRL3135的phyA基因的同源性为92．4％(不计内含子),编码1个含449个氨基酸残基的蛋白质,推导的氨基酸序列同源性为95．1％。将该基因与分泌型载体pPIC9K连接,构建了植酸酶基因的重组酵母表达载体pPIC9K／phyA。