创伤弧菌毒力相关因子的全基因组关联分析研究

【目的】创伤弧菌是致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。本研究以创伤弧菌分离来源(临床和环境)作为不同表型,通过与260株基因组序列进行关联分析,挖掘毒力相关因子,从而进一步了解创伤弧菌致病因素。【方法】对139株创伤弧菌分离株进行高通量测序,获取其全基因组序列;与公共数据库已公开发表的121株基因组整合,使用pyseer软件进行全基因组关联分析,对与不同分离来源显著相关的基因进行注释和解读。【结果】共发现11个基因与临床分离株显著相关,其中9个是本研究新发现的创伤弧菌潜在毒力相关因子。【结论】本研究使用群体基因组学和统计遗传学方法,在全基因组范围扫描挖掘了创伤弧菌毒力相关因子,为深入揭示该物种致病机制、设计新的疫苗和治疗靶点提供了重要依据。     

基于pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性变化及影响

【背景】基于自杀载体的基因敲除在单基因敲除上的应用较为常见,但在多基因敲除过程中细菌耐药性的变化及对后续敲除的影响尚未明确。【目的】探究基于自杀载体pDS132的创伤弧菌vvhA与rtxA1双基因敲除株构建过程中,创伤弧菌对氯霉素耐药性的变化及对后续基因敲除的影响。【方法】基于自杀载体pDS132的同源重组法构建创伤弧菌YJ016的单基因敲除株YJ016-ΔvvhA、YJ016-ΔrtxA1和双基因敲除株YJ016-ΔvvhAΔrtxA1,记录单交换筛选时的氯霉素浓度与筛选平板上成功重组的菌株所占比例。琼脂稀释法测定野生型与敲除株的氯霉素最低抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration,MIC)和抗性突变频率,纸片扩散法测定菌株对其他药物的敏感性,分析其对单交换筛选的影响。【结果】单基因敲除株的氯霉素MIC及氯霉素抗性突变频率高于野生型;双基因敲除株的庆大霉素抑菌圈直径小于野生型。单基因敲除时,单交换重组菌株的占比为100%(20/20);在YJ016-ΔvvhA上敲除rtxA1基因,氯霉素筛选浓度为2、4μg/mL时,单交换重组菌株的占比分别为40%(8/20)、5%(1/20);在YJ016-ΔrtxA1上敲除vvhA基因,氯霉素筛选浓度为2、4μg/mL时,单交换重组菌株的占比均为0%(0/20)。【结论】基于自杀载体pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性升高,可能影响后续单交换重组的筛选,该结果为基于自杀载体的同源重组技术应用于多基因敲除提供了参考。     

应用xMAP液念芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的：建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法：根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果：xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论：xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

GnRH-PEⅡ-luffinS重组嵌合毒素的制备与细胞毒性检测

目的：制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素（GnRH Ⅰ）为导向部分,以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ（PEⅡ）为转膜区,以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS,体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶（rEK）切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa、A549、HepG-2、SP2/0和鸡胚成纤维细胞（CEF）的体外细胞毒作用。结果：成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为94％。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa、A549、HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,而对CEF无作用。结论：重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。     

胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coli M15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.     

A型肉毒毒素轻链基因的克隆及其结构分析

以献报道的A型肉毒毒素基因全序列为标准,设计并合成一对引物,自肉毒梭菌基因组中扩增出肉毒毒素轻链基因片段,并将扩增产物与pGEM—T载体在体外连接,构建测序重组质粒,进行测序和基因结构分析。PCR扩增获得了产物为1 364bp的DNA片段,测序结果与DNA数据库对照检索分析证明,此基因片段与GenBank中的A型肉毒毒素LC基因的一致性达99．9％以上,可以认为克隆的基因为A型肉毒毒素LC基因。     

免疫毒素的抗肿瘤研究

免疫毒素是由具有导向能力的载体（抗体或细胞因子）和具有细胞毒性的分子（毒素）偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子,是一种靶向药物。免疫毒素首先利用肿瘤细胞上导向分子的受体与细胞结合,然后进入细胞,再由毒素发挥蛋白质合成抑制作用,最终导致靶细胞死亡。与其他抗肿瘤药物相比,免疫毒素具有毒性强和特异性高的优点,在肿瘤治疗中显示出巨大的应用前景。简要概述了免疫毒素的作用机理、制备及其抗肿瘤研究进展。     

重组肉毒神经毒素A轻链(BoNT/A LC)突变体的构建、表达与活性分析

A型肉毒神经毒素的轻链(BoNT/A LC)是一种锌依赖性的金属内肽酶.通过X射线分析其结构并结合一些文献报道表明,轻链上的Arg362和Tyr365直接参与了酶的催化作用,而Glu350则处于其活性位点的中心位置.采用定点突变技术,对编码这3个关键性的氨基酸位点的碱基进行突变(Arg362Ala、Tyr365Phe、Glu350Ala),获得了BoNT/A LC突变体.突变体蛋白与BoNT/A的底物蛋白SNAP-25进行切割反应,结果表明,未经突变的BoNT/A轻链蛋白能够特异性地识别SNAP-25蛋白上的Q197-R198位点,而突变体蛋白则完全无法识别该位点,不具有金属内肽酶活性,成功地去除了肉毒神经毒素的毒力,为下一步的全长肉毒神经毒素重组疫苗的研究打下了基础.     

重组蓖麻、相思子毒素A链嵌合突变体的制备与分析

目的:构建蓖麻毒素(RIC)、相思子毒素(ABR)A链突变体的嵌合体蛋白,实现嵌合体蛋白的可溶性表达、纯化及抗原性分析。方法:采用柔性linker连接RIC A链突变体(mRICAD75AV76MY80A)和ABR A链突变体(mABRAE164AR167L),构建嵌合体基因mRICA/mABRA,将该嵌合体基因亚克隆至原核载体pQE80L构建表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA,再转化至大肠杆菌M15获得表达工程菌株M15/pQE80L-mRICA/mABRA,工程菌在18℃经0.1 mmol/L的IPTG诱导14 h,表达的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,通过ELISA和Western印迹检测嵌合体蛋白的抗原性。结果:所获得的mRICA/mABRA嵌合体基因经一致性比对分析,与预计嵌合基因的序列一致性为100%,其开放读框全长1572 bp,编码524个氨基酸残基;重组表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,嵌合体蛋白相对分子质量约为62×103,与预测相符,可溶性的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,纯度可达99%;间接ELISA和Western印迹结果表明,嵌合体蛋白能同时与抗RIC多克隆抗体和抗ABR多克隆抗体发生特异的抗原抗体反应。结论:得到的mRICA/mABRA嵌合体蛋白具有良好的抗原性,为研制新型RIC和ABR双价疫苗奠定了重要基础。