大黄鱼肌肉生长抑制素-1前肽原核表达、多克隆抗体制备和功能验证

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)在动物肌肉的生长和发育过程中起着重要作用。该研究通过RT-PCR从大黄鱼(Larimichthys crocea)肌肉组织中克隆肌肉生长抑制素-1前肽基因(MSTN-1pros),构建了表达大黄鱼生长抑制素前肽的重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,获得了大黄鱼MSTN-1pros融合蛋白。用分离的重组蛋白免疫大白兔,制备了抗大黄鱼MSTN-1pros的多克隆抗体。经蛋白免疫印迹法检测,确定获得的抗体具有较高的特异性。通过对大黄鱼幼鱼的注射实验,发现注射过MSTN-1pros抗体的大黄鱼增重率比对照组降低了20.71%(P0.05),证明MSTN前肽抗体对大黄鱼的生长具有抑制作用。实验结果表明,MSTN前肽蛋白可以用于养殖鱼类的生长调控。     

大肠埃希菌耐药性水平传播实验研究

目的研究重症监护病房（ICU）患者标本中分离的大肠埃希菌的耐药情况以及耐药性水平传播的实验研究。方法采取双纸片法（K-B）检测细菌的耐药性;产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌为供体菌,耐利福平大肠埃希菌（对其他抗生素敏感）作为受体菌进行接合实验;采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增整合子和耐药基因。结果30株大肠埃希菌中产ESBLs菌株检出率为46．7％;接合培养后,接合菌携带23kb和25kb大质粒,而无供体菌中一系列小质粒;供体菌和接合菌均携带I型整合子。结论大肠埃希菌耐药性严重,且呈多重耐药性;产ESBLs菌株可通过质粒和整合子将耐药基因转移给敏感菌,导致耐药性传播。     

乙肝病毒突变核心蛋白基因的克隆及序列分析

目的克隆发生长片段缺失的乙肝病毒核心蛋白基因（HBV-C）,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法通过PCR从1株乙型肝炎病毒中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,利用TA克隆将PCR产物克隆人pUCm—T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果PCR扩增出的HBV-C基因经序列分析表明长度为454bp,其核苷酸序列缺失了220—317bp之间的98个碱基,造成从74个氨基酸起发生移码突变。结论成功克隆发生长片段缺失的HBV-C基因,为表达及功能研究奠定了基础。     

临床分离鲍曼不动杆菌的外排泵基因检测及同源性分析

目的探讨临床分离鲍曼不动杆菌主动外排基因的分布和菌株克隆相关性,为指导临床合理用药和制定恰当的感染控制措施提供理论依据。方法对临床分离的80株鲍曼不动杆菌采用琼脂稀释法检测对抗菌药物的敏感性,聚合酶链反应(PCR)检测adeB、adeG、adeJ外排泵基因的携带情况,脉冲场凝胶电泳法分析多重耐药鲍曼不动杆菌的同源性。结果 80株临床分离鲍曼不动杆菌中,57株为多重耐药株(MDRAB),且对多粘菌素B、头孢哌酮/舒巴坦和美罗培南较为敏感,对其他临床常用抗生素普遍耐药。adeB、adeG、adeJ外排泵基因分布广泛,在敏感菌株中存在率也很高;PFGE分型结果显示57株MDRAB菌株共分为四大群(A、B、C、D),并以流行克隆A为主。结论临床分离鲍曼不动杆菌耐药形式严峻,其临床分离株普遍存在外排泵编码基因adeB、adeG、adeJ,携带外排泵阳性MDRAB菌株的克隆播散是温州地区鲍曼不动杆菌发生耐药的机制之一。     

大肠埃希菌Mn-SOD基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

目的实现Mn-SOD基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达,制备Mn-SOD的多克隆抗体。方法用PCR方法从一株野生型大肠埃希菌（E.coli）基因组中扩增Mn-SOD基因编码区．将它克隆到原核表达载体上进行大量表达和纯化,再用纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清,用Western-blot印迹实验测定抗体效果。结果SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50％;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921．77U／mg,是对照BL21的276．77倍;并制备了高效价的多克隆抗体。结论该研究成功地构建了大肠埃希菌Mn-SOD基因高效原核表达系统,所表达的Mn-SOD具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对大肠埃希菌所产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）进行基因克隆和重组表达,探讨其特性。方法以产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌12号菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CTX-M-14,将其克隆入pUCm-T Vector载体后测定该核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体pET-28α,构建含CTX-M-14基因的重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定表达的酶蛋白后再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠埃希菌BL21转化pET-28a／CTX-M-14重组质粒后,ESBLs试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量大约为30KD。结论成功表达重组的CTX-M-14型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子调控条件的优化

目的 构建大肠埃希菌BL21 Mn-SOD-RFP报告基因载体,并探讨温度对大肠埃希菌Mn-SOD基因启动子的调控.方法 利用重组PCR技术,构建以Mn-SOD启动子调控的红色荧光蛋白(RFP)报告基因载体,将融合基因与T载体连接导入大肠埃希菌中,在不同温度(20、37、40和45℃)培养不同时间(13、20、30、37、44和54 h)后,利用荧光显微镜和荧光光度计观察大肠埃希菌表达RFP的情况.结果 正确构建Mn-SOD-RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致;不同温度不同时间诱导后,Mn-SOD启动子在37℃,培养30～ 37 h表达的红色荧光蛋白最多.结论 成功构建该报告基因载体,并完成温度、时间对其调控的优化,为更进一步研究其他因素对SOD基因启动子的调控机制奠定基础.     

藻蓝蛋白抑制人结肠癌SW480细胞增殖的初步研究

目的研究藻蓝蛋白对人结肠癌SW480细胞的体外抑瘤作用,为进一步探讨藻蓝蛋白抑制肿瘤的机制提供依据。方法用不同浓度的藻蓝蛋白处理结肠癌SW480细胞后,应用MTT实验来检测藻蓝蛋白对细胞增殖的抑制作用并计算出半数抑制率,利用HE染色法和电镜技术观察凋亡细胞形态结构,采用流式细胞术分析其对SW480细胞周期的影响。结果 MTT试验证明藻蓝蛋白能够抑制SW480细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性;HE染色以及电镜的观察结果显示藻蓝蛋白能够诱导SW480细胞的凋亡,流式细胞术显示SW480细胞被阻滞在G2/M期,G0/G1期细胞比例降低。结论藻蓝蛋白在体外能够抑制结肠癌SW480细胞的增殖,具有可开发人结肠癌治疗光敏剂应用前景。     

临床分离肺炎克雷伯菌Ⅰ类整合子的结构与功能

为了探索细菌多重耐药性的产生和播散的分子机制, 文章对2002～2007年间179株临床分离的肺炎克雷伯菌进行耐药性、I类整合子可变区基因盒结构以及基因盒携带的耐药性基因进行分段克隆和耐药性功能测定。结果显示：65.9%(118/179)的肺炎克雷伯菌表现出对至少两种以上的抗生素(主要为β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物)的耐药性; 36.3%(65/179)的菌株检出单条或者双条I类整合子基因盒条带; 对整合子阳性组与阴性组的耐药率进行比较发现, 除氨基糖苷类、喹诺酮类和复方新诺明等药物的耐药性存在显著性差异(P<0.01)外, 其余药物的差异不显著; 共发现15种耐药基因构成形式的整合子基因盒, 其中以dfrA17-aadA5最为多见, 实验证明整合子可由接合转移耐药性质粒携带; 对整合子基因盒(dhfr17-orfF-aadA2)分段克隆的耐药性功能研究发现, 3个克隆重组子(pET28a-dhfr17、pET28a-dhfr17-orfF和pET28a-dhfr17-orfF-aadA2)对复方新诺明的抗性(MIC值)均为256 µg/mL, 重组子pET28a-dhfr17-orfF与重组子pET28a-dhfr17对链霉素的抗性无明显区别, 和受体菌一样MIC值均为8 µg/mL, 而pET28a-dhfr17-orfF-aadA2对链霉素的抗性则明显提高, MIC值为256 µg/mL。结果表明, I类整合子在肺炎克雷伯菌中较常见, 携带氨基糖苷类和甲氧苄啶类的耐药基因盒在数量上占优势, 且整合子携带的耐药基因具有耐药性功能, 位于可水平转移耐药性质粒的耐药性基因相关的整合子对病原菌耐药性播散具有重要意义。 目的基因