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1.
为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物,利用一种新的cDNA末端快速扩增方法(SMARTRACE)扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与mRNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA.结果表明,SMARTRACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术. Abstract:To clone the full-length cDNAs of genes related to spermatogenesis,ESTs obtained by mRNA differential display were used to design gene-specific primer.Then SMART RACE was performed to obtain the 5′ region of these ESTs.After cloning,sequencing and splicing with ESTs obtained by mRNA differential display,three full-length cDNAs were obtained.The results indicate that SMART RACE is a simple and an effective technique for cloning 5′-end unknown sequence of gene.  相似文献   
2.
短发夹 RNA 介导 RNA 干扰的时间 和剂量效应研究   总被引:9,自引:0,他引:9  
用 RNA 干扰 (RNA interference , RNAi) 技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中 RNAi 作用的剂量和时间效应 . 应用 Lipofectamine 2000 将外源报告基因的表达载体与编码短发夹 RNA (short hairpin RNA , shRNA) 的质粒共转染 HEK293H 细胞,观察 shRNA 载体对报告基因的抑制效应 . 转染后, shRNAs 的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达 . 在共转染后 12 , 24 , 48 , 60 , 72 , 96 h 时检测 EGFP (enhanced green fluorescent protein , EGFP) 基因 mRNA 及蛋白质表达水平,结果显示, EGFP mRNA 及蛋白质表达在 12 h 时略有降低, 24~48 h 时表达逐渐降低, 48~72 h 时降低最明显,其后 EGFP 表达水平逐渐恢复 . 提示该过程中 RNAi 效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势 . 共转染一系列剂量比例的 EGFP 干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内, RNA 干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一“平台期” . 此外,通过 RNAi 抑制 HeLa 细胞、 HEK293 细胞中荧光素酶基因的表达, 荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应 . 这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的 RNAi 作用呈现剂量和时间依赖性效应 . 这为基于载体表达的 RNAi 技术应用研究提供了一定的理论参考及依据 .  相似文献   
3.
一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法   总被引:5,自引:1,他引:4  
邱为民  张思仲  武辉  张戈  肖翠英 《遗传》2001,23(5):480-482
为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物。利用一种新的cDNA末端快速扩增方法(SMART RACE)扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与cDNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA。结果表明:SMAR RACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术。  相似文献   
4.
一种单核苷酸多态性的单倍型分析技术   总被引:3,自引:0,他引:3  
运用多步PCR和测序技术,完成基因组中相距较远的单核苷酸多态位点的单倍型构建。通过设计2条等位基因特异性引物,扩增大片段DNA(10kb左右),以此大片段DNA作为下一轮PCR反应的模板,再在该片段中设计待检测区域的PCR引物,进行第2轮PCR。对PCR产物进行测序分析,确定其多态位点处的等位基因。结合第1轮PCR中的等位基因特异性引物,即可确定该大片段DNA中不同单核苷酸多态性构成的单倍型。以脂蛋白脂酶基因为例,应用其启动子区以及第4外显子区的等位基因特异性引物扩增约16kb的DNA片段,然后检测位于该片段中第2、3外显子的多态性。在£-尸£-基因第2内含子中发现了 13557G→A多态性。经分析确定出-421G/ 13557G/ 15222A、-421A/ 13557G/ 15222A、-421G/ 13557G/ 15222G、-421G/ 13557A/ 15222A等4种单倍型。等位基因特异性PCR结合小片段测序是一种快捷高效的对相距较远的多个SNP进行单倍型构建的新策略。  相似文献   
5.
有和无甘油的聚丙烯酰胺胶在检测突变时的差别   总被引:8,自引:0,他引:8  
丁兰  武辉  肖翠英  周宏远  张思仲 《遗传》2001,23(3):266-268
有文献报道在非变性的聚丙烯酰胺中加入甘油可提高SSCP检测的灵敏度。我们的实验结果建议研究者在进行SSCP筛查未知突变时最好采用不加甘油的非变性的聚丙烯酰胺胶,这既省力省钱,又灵敏。在判读SSCP胶时,千万不要看到在双链带位置有一条比正常迁移率慢的带就判定为插入突变。此时要判定突变的性质,最好测序。 Abstract:It was reported that glycerol in the non-denatured SSCP polyacrylamide gel could increase the sensibility of detecting mutation. We detected the mutation of PKD 1 gene in the patients with autosomal dominant polycystic kidney disease.PCR com bined with SSCP(single-strained conformation polymorphism),the non-denatured 10% polyacrylamide gel without glycerol or 10% polyacrylamide gel with 5% glycerol and DNA sequencing method were used.Our results showed that four single strand b ands were found in the non-denatured polyacrylamide gel without glycerol while t wo single strand bands were found in the polyacrylamide gel with glycerol in the same patient.Sequence showed there is a deletion of G in one DNA molecular and a G→A substitution in another DNA molecular in the patient with abnormal shift SSCP bands.Therefore, our experiment suggested that non-denat ured polyacrylamide gel was better than the polyacrylamide gel with glycerol in detection mutation,and it will save labor and money.It also suggeste d that one basedeletion can cause a slow double-strand DNA following the normal double strand band,which was caused by the heterogeneous DNA molecule formed bet ween the normal DNA strand and the one base deletion DNA strand with the protrud ing base.Our results suggest that when judging mutation in SSCP gel,it is not re liable to decide that mutation is inversion according to slow mobility in the ge l,and when the characteristic of mutation need to be judged,it must be sequenced .  相似文献   
6.
强直性肌营养不良(myotonic dystrophy,DM)是由于DMPK基因3′非翻译区CTG重复序列异常扩展所致的、主要累及神经肌肉系统的常染色体显性遗传病。在该基因的第8内含子中还存在一个Alu重复序列的1kb插入/缺失多态性,即Alu±1kb多态性。为了帮助阐明汉族人群中DM突变的起源,并为解释DM在不同群体中发病率的差异提供更多依据,本文从300例已知CTG拷贝数的正常汉族群体中随机挑选60例,首先通过PCR扩增确定其Alu±1kb多态性,然后对Alu±1kb和CTG双杂合的标本,采用长PCR方法先行扩增含Alu±1kb和CTG重复序列的DNA片段,再分别对含Alu(+)和Alu(-)的DNA片段中的CTG拷贝数进行常规PCR分析,以确定二位点的单倍型。结果表明60例正常人中二位点间呈连锁不平衡。其单倍型为:(CTG)5均与Alu(+)连锁;多数(CTG)11~14与Alu(-)连锁;在两个(CTG)≥19的等位基因中一个与Alu(+)连锁,另一个与Alu(-)连锁。各民族相关资料的比较提示,汉族人群中(CTG)11~14与非洲黑人的起源可能不同;(CTG)19~30/Alu-1kb在汉族人群中的频率远比欧洲人群的高;(CTG)19~30/Alu-1kb与(CTG)19~30/Alu+1kb在汉族人群中是以一定比例共存的;(CTG)19~30在不同民族间的起源不尽相同;如果从(CTG)5到(CTG)19~30的假设成立的话,则很可能是一个较为复杂的过程。 Abstract:Myotonic dystrophy(DM),an autosomal dominant disease of the neuromascular system,is caused by expansion of the CTG repeats in the 3'untranslated region of the DMPK gene.In the eighth intron of this gene,there is another polymorphism-the insertion/deletion of 1kb Alu repeat(Alu±1kb).In order to help elucidate the origin of DM mutation in Chinese Han patients,and explain the difference of incidence of DM in different populations,60 normal Han individuals were randomly chosen from 300 Chinese,whose CTG copy number had been previously ascertained.The polymorphism of Alu±1kb of the 60 cases were firstly analyzed by in vitro amplification;then the 22 cases in which both sites were heterozygous were analyzed as following:the fragments containing both Alu±1kb and CTG repeat sequence were first amplified by long PCR method;and then the CTG copy numbers were analyzed in the Alu(+)and Alu(-)alleles.In the 60 cases studied,a remarkable linkage disequilibrium between CTG triplet repeats and Alu±1kb were observed.All the(CTG)5 alleles were linked with Alu(+),and most of the(CTG)11-14 alleles were linked with Alu(-);one of the two alleles of(CTG)≥19 was linked with Alu(+),the other was linked with Alu(-).This suggests that the origin of(CTG)11-14 in Chinese Han may be different from that of African Blacks;the frequency of (CTG)19-30 /Alu-1kb in Chinese Han might be much higher than that in Europeans Caucasians.The(CTG)19-30/Alu-1kb and(CTG)19-30/Alu+1kb coexist in Chinese Han in some proportion;the origin of (CTG)19-30 in different population may be different;if the hypothesis of(CTG)5 to(CTG)19-30 is true,then the progress should have been a relatively complicated process.  相似文献   
7.
利用PCR、UT-PCR、克隆及测序等技术,对强直性肌营养不良基因(MT-PK)3′-非翻译区分别用Taq,Taq+Pwo DNA聚合酶进行了扩增、克隆和测序,研究了PCR产物末端组成情况,并比较了上述两种DNA聚合酶对PCR产物末端的影响.结果在用Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物主要得到3′端突出1个A(占67.3%,35/52);在Taq+Pwo DNA聚合酶扩增的PCR产物末端中得到3′端+A的仅占17.4%,而-1的占34.8%,与前者显著不同.表明PCR扩增产物的末端是复杂多样的.  相似文献   
8.
肽核酸量类NDA结构类似物,是有效的反义/抗基因靶向性制剂,不被核酸酶、蛋白酶及肽酶等降解,与DNA/RNA形成的杂交体非常稳定,在抗病原体、抗肿瘤和分子杂交、PCR反应、基因分离等分子生物学领域显示出强大的应用潜力。  相似文献   
9.
脂蛋白脂酶基因的克隆、序列测定及定点突变   总被引:1,自引:0,他引:1  
 以人的脂肪组织总RNA为模板 ,参考已报道的脂蛋白脂酶 (lipoproteinlipase ,LPL)cDNA设计引物 ,利用RT PCR方法扩增得到了LPLcDNA ,并经序列测定证实其序列是正确的 .在冠心病患者LPL基因第 5外显子的 830位碱基处发现了G→A的转换 ,该变异导致LPL基因第 192位的密码子CGA被CAA取代 ,使LPL第 192位精氨酸改变为谷氨酰胺 .在变异碱基附近设计合成两条引物 ,其中一条包含所要改变的碱基 ,利用基于PCR的定点突变技术和体外重组的方法获得了G830A变异的LPLcDNA  相似文献   
10.
强直性肌营养不良(myotonic dystrophy,DM)是由于DMPK基因3′非翻译区CTG重复序列异常扩展所致的、主要累及神经肌肉系统的常染色体显性遗传病.在该基因的第8内含子中还存在一个Alu重复序列的1kb插入/缺失多态性,即Alu±1kb多态性.为了帮助阐明汉族人群中DM突变的起源,并为解释DM在不同群体中发病率的差异提供更多依据,本文从300例已知CTG拷贝数的正常汉族群体中随机挑选60例,首先通过PCR扩增确定其Alu±1kb多态性,然后对Alu±1kb和CTG双杂合的标本,采用长PCR方法先行扩增含Alu±1kb和CTG重复序列的DNA片段,再分别对含Alu(+)和Alu(-)的DNA片段中的CTG拷贝数进行常规PCR分析,以确定二位点的单倍型.结果表明60例正常人中二位点间呈连锁不平衡.其单倍型为:(CTG)5均与Alu(+)连锁;多数(CTG)11~14与Alu(-)连锁;在两个(CTG)≥19的等位基因中一个与Alu(+)连锁,另一个与Alu(-)连锁.各民族相关资料的比较提示,汉族人群中(CTG)11~14与非洲黑人的起源可能不同;(CTG)19~30/Alu-1kb在汉族人群中的频率远比欧洲人群的高;(CTG)19~30/Alu-1kb与(CTG)19~30/Alu+1kb在汉族人群中是以一定比例共存的;(CTG)19~30在不同民族间的起源不尽相同;如果从(CTG)5到(CTG)19~30的假设成立的话,则很可能是一个较为复杂的过程.  相似文献   
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