丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆与表达

以含有丙型肝炎病毒核心蛋白基因的质粒pJLA502-C为模板,用PCR方法重新扩增克隆了核心蛋白基因,在扩增基因的上下端分别增加了NCOⅠ及SalⅠ酶切位点。将克隆的基因酶切后插入表达载体pBV221内,转化大肠肝菌DH_(5α),获得表达非融合核心蛋白的工程菌,42℃热诱导5hr,表达蛋白占菌体蛋白总量的15％。经包涵体纯化及分子筛纯化等,获得核心蛋白,经ELISA及Western Blotting分析表明有较好的抗原性和特异性。     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

幽门螺杆菌cagA克隆表达

克隆表达4株幽门螺杆菌的cagA基因,以方便地获得大鼠CagA蛋白和重组表达质粒,为临床诊断CagA阳性幽门螺杆菌感染,以及进一步研究不同类型CagA功能及其与疾病关系提供材料。PCR扩增幽门螺杆菌的cagA基因,克隆至PinPoint^TMXa-1T载体,酶切鉴定连接方向,IPTG诱导正向连接克隆表达CagA融合蛋白并进行SDS－PAGE和Western blots鉴定。结果显示PCR扩增得到3.5-3.8kb的CagA基因,PCR及酶切鉴定得到正向连接的重组克隆,SDS－PAGE及Western blots证实正向连接的重组克隆表达CagA融合蛋白。构建了4种cagA的重组表达质粒,通过转化同一宿主菌可研究不同CagA的功能和致病性差异;通过亲和层析纯化融合蛋白可获大量CagA蛋白,用于血清学诊断CagA阳性幽门螺杆菌感染,及不同抗原性CagA与疾病之间的关系。     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶在大肠杆菌表达的研究

研究重组EB病毒胸苷激酶(thymidine kinase of Epstein-Barr virus,EBVTK)在大肠杆菌中的表达,将EB病毒的tk基因与原核表达载体pBV220进行重组,构成质粒pBV220/tk,并在大肠杆菌DH5α中获得表达;采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定,SDS-PAEG电泳和Western blot反应检测蛋白的表达。结果显示成功地构建了pBV220/tk质粒,并有重组蛋白的表达,该重组蛋白可与鼻咽癌病人血清发生特异性反应。结果表明该重组蛋白可作为抗原应用于鼻咽癌病人血清TKIgA抗体的检测,为重组TK的生产,临床应用提供了实验依据。     

人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达

用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以人肝细胞总RNA为模板, 扩增了人锰超氧化物歧化酶(hMnSOD)的cDNA片段, 将此cDNA克隆到载体pGEM-T中.对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定, 确定为含hMnSODcDNA的重组质粒将该hMnSODcDNA重组到表达载体pBV220内, 重组质粒在大肠杆菌DH5-α中表达hMnSOD, 表达产物占菌体总蛋白的14%, 具有持异性SOD酶活性.     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原基因（λMZ5—7）在大肠杆菌中的表达

将重组克隆质粒（PGEM－λMZ）用EooRⅠ酶切后,电泳回收目的的片段,克隆到经EooRⅠ酶切、CIAP处理的表达载体pET－28a中,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,得到的转子化经PCR鉴定和酶切分析,筛选出符合正确阅读框的重组子,构建成重组表达质粒（PET－λMZ）,并在大肠杆菌BL21（DE3）表达菌中成功地表达了含目的蛋白的融合蛋白,融合蛋白的分子量的34KDa,加入IPIG诱导6h后,蛋白表达接近最高 水平。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS－PAGE检测为要带。经Western-blotting杂交实验,纯化出的目的蛋白能与兔抗E．tenella第二代裂殖子抗血清发生反应,说明MZP蛋白是E．tenella第二代裂殖子抗原蛋白,具有一定的免疫原性,为进一步研究重组疫苗创造了一定的条件。     

大黄鱼MSTN成熟肽区基因的原核表达

根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。     

肿瘤坏死因子相关凋亡受体(TRAIL)cDNA的克隆及高效表达

为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM-Tvector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV220构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经凝胶薄层扫描 ,对pBV TRAILD DH5α工程菌热诱导 5h ,TRAIL衍生物蛋白的表达量最高约占菌体可溶性总蛋白的 31 %。人TRAIL基因 ,通过pBV2 2 0原核表达载体可在大肠杆菌中获得高效表达。     

表达产物可用IMAC快速纯化的原核表达载体的组建与应用

以原核高效表达载体pBV,220为骨架载体,采用互补寡核苷酸插入法在pBV220多克隆位点的上游插入了起始密码子和6组氨酸编码序列,将此新质粒命名为pBV222,以此载体表达的目的蛋白在N-段带有His6尾以利于IMAC层折快速纯化目的蛋白,酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将IL-2和GM—CSF cDNA克隆入pBV222载体中,表达的目的蛋白与预期的分子量相同,表达产物以包涵体的形式存在,表达量比非融合蛋白有明显的提高。且这种融合蛋白保留GM-CSF的生物学活性。表达菌体直接用6mol／L盐酸胍裂解或首先分离包涵体之后盐酸胍裂解,上清直接IMAC层析,以阶段性或线性pH梯度洗脱特异的目的蛋白。SDS-PAGE分析蛋白纯度在90％以上。     

高效原核表达载体pBV220的改造与应用

以高效原核表达载体 pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(6×His-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点, 并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA, 将此新质粒命名为 pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白, 酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-H1 cDNA克隆入pBV223载体中, 在大肠杆菌DH5a中成功地表达了Nm23-H1蛋白, 通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

纳豆激酶基因在E.coli HB101中的初步表达研究

利用PCR技术以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到温度诱导型表达形体pVB220上,转化E．coliHB101,获得转豆激酶基因重组菌。在确定了其最佳培养时间与诱导时间后,SDS－PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12％左右,液体发酵后纳豆激酶产量可达120U／ml菌液,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差。     

丙型肝炎病毒C+E1区基因在原核细胞中的克隆与表达

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因插入到原核高效表达载体ｐＢＶ２２１质粒中,构建了质粒ｐＢＶ２２１ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１作为表达载体,然后,将含有该质粒的宿主大肠杆菌进行升温诱导表达ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１区基因,并对表达产物进行了生物活性的检测。结果表明,插入到表达载体ｐＢＶ２２１中的ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１基因片段能够得到有效的表达,表达产物主要为非融合蛋白形式存在于细胞中,同时这种Ｃ区和Ｅ１区连接共表达的产物保持了良好的抗原活性     

解毒酶基因cDNA克隆和高效表达

昆虫抗药性的一个重要机制是其产生的解毒酶可以将大剂量的农药脱去毒性[1] 。酯酶活性升高是库蚊对有机磷杀虫剂抗性的主要机制 ,与酯酶Ｂ1有关的抗性最高[2 ,3] 。酯酶与有机磷杀虫剂有非常强的结合力 ,可以迅速与之形成强结合体[4 ] 。酯酶的解毒作用具有很高的手性专一性 ,在有机磷化合物 ,特别是高毒的有机磷化合物的解毒作用中非常重要[1] 。高效表达解毒酶基因 ,将昆虫解毒酶用于人畜解毒的目的研究还未见报道。本文报道在大肠杆菌中高效表达昆虫解毒酶 ,并将产物用于实验动物有机磷中毒的解毒研究 ,为昆虫抗性相关基因的开发利用提…     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建,表达和？…

将化学合成的ＲＧＤ肽（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）编码寡核苷酸与尿激酶Ｂ链ｃＤＮＡ相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒ｐＢＶ２２０中,在ＰＲＰＬ自动子的作用下,经４２℃热诱导,在大肠杆菌ＤＨ５α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的９．２％,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,     

重组鼠干细胞因子的原核表达、纯化及生物活性初步分析

目的：研制重组鼠干细胞因子（rmSCF）,并检测其体外生物学活性。方法：提取BALB/c孕龄鼠总RNA,通过RT-PCR扩增mSCF的编码基因,将其克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,将重组菌株接种至氨苄青霉素抗性的LB培养基中,扩大培养至5L发酵罐中,42℃诱导表达,经包涵体复性、DEAE-SepharoseFF和Phenyle-SepharoseHP层析纯化,制备rmSCF。结果：构建了pBV220-mSCF原核表达载体,在大肠杆菌中表达了rmSCF,纯化后的rmSCF对类原巨核细胞白血病细胞系的UT-7细胞有明显的刺激作用,比活为1.0×106U/mg。结论：获得了纯度大于95%的rmSCF,将进一步展开其在小鼠体内的药效学研究。     

胸腺素α原融合蛋白基因表达、纯化与生物学活性

胸腺素α原及胸腺九肽在体内免疫方面有重要作用 .根据大肠杆菌遗传密码的偏爱性 ,设计并人工合成了胸腺素α原及胸腺九肽融合蛋白的特异引物 .以胸腺素α原cDNA为模板 ,应用PCR及分子克隆技术构建了该融合蛋白的编码基因 ,将其插入pBV2 2 0质粒 ,转化大肠杆菌 ,通过温度诱导使该融合蛋白高效表达 ,并对表达产物进行了高效特异性纯化 .运用MTT法初步测定了该融合蛋白的活性 .结果表明 ,该融合蛋白对氢化可的松诱导的胸腺细胞损伤有一定的保护作用 ,为今后进一步研究和应用该融合蛋白奠定了基础     

乙型肝炎病毒X基因的分析与在大肠杆菌中的表达

以ＨＢＶ－ＮＣｌＤＮＡ为材料研究了其中的Ｘ基因,首先确定了此Ｘ基因的顺序,即用ＡＢＩ自动萤光测序议测序证明了此Ｘ基因的３８５位核苷酸后缺失１９个核苷酸,从而引起移码突变,使此Ｘ基因共有５１９个核苷酸,编码１７２个氨基酸,比另一种ａｄｒ型Ｘ蛋白多１８个氨基酸。在其第五位氨基酸上有一ＡＴＧ起始密码,也与另一Ｘ基因不同。经重组后获得在大肠杆菌中的热诱导表达,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法证明确为Ｘ蛋白,并有多态性。     

人血清Q型对氧磷酶在大肠杆菌中的表达

目的:应用大肠杆菌原核表达系统高效表达人血清Q型对氧磷酶(PON1)。方法:从pBlueScript-PON1重组质粒中通过PCR扩增得到了人PON1基因,将其亚克隆至原核表达载体pBV220中,构建了重组表达质粒pBV220-PON1,转化大肠杆菌,获得表达菌株。结果:rhPON1重组蛋白以不溶形式存在于包涵体中。凝胶扫描分析表明,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的18%。包涵体经分离、变性、复性等步骤处理后,产物未显示酶活性。结论:原核表达的rhPON1以包涵体形式存在,实现了人PON1在大肠杆菌中的高效表达。