黑曲霉FS25产β—葡萄糖酶发酵特性的研究

黑曲霉(Aspergillusniger)FS25产β-葡聚糖酶最适碳源为大麦粉,氮源为玉米浆;最佳摇瓶发酵配方为大麦粉6g,玉米浆2g,(NH4)2SO40.4g,FeSO4@7H2O0.01g,Na2HPO4@3H2O0.1g,CaCO30.5g,MgSO4@7H2O0.03g,麦麸0.8g,发酵初始pH为5.0,定容100mL.发酵温度为32℃,250mL三角瓶发酵液的装量为50mL,接种量为1.5mL孢子悬液(1.5×107个/mL);发酵周期为30h,酶活达到80.1u/mL,比初始的产酶水平提高了84.1%.     

β-葡聚糖酶高产菌株BS9418F的选育及其发酵条件的研究

经60 Coγ射线辐照处理获得的诱变菌株芽孢杆菌BS9418F ,其产酶活力比出发菌株提高 30 %以上。该菌株以大麦粉 7%、玉米粉 3%、豆粕 3%及适量无机盐为培养基最佳配比 ,其最适培养条件为 :培养基初始 pH 7.0 ,摇瓶装量 5 0mL/ 30 0mL三角瓶 ,种龄 16～ 2 0h ,接种量 2 %～ 3% ,培养温度 36～ 37℃ ,发酵周期 40h。在优化条件下 ,摇瓶发酵产 β 葡聚糖酶活力高达 5 5 0 0u/mL以上 ,比出发菌株初始发酵水平提高了 4倍以上     

极地适冷菌Pseudoalteromonas sp. QI-1产适冷蛋白酶发酵条件的优化

对极地适冷菌Pseudoalteromonas sp. QI-1产适冷蛋白酶的发酵条件进行优化。结果表明:菌株QI-1的最适生长和产酶温度均为5℃;最佳接种量为1%;发酵培养基的最适初始pH和最佳装样量分别为5和10%;盐度为2%时对菌株的生长和产酶最为有利;麸皮和醋酸钠分别为最佳N源和C源;添加0.75%酪蛋白时菌株QI-1胞外蛋白酶的活性最高;10 mmol/L Mg2+和0.5%Tween-80有利于产酶。正交试验结果表明:菌株Pseudoalteromonassp. QI-1产蛋白酶较佳培养基配方(g/L)为麸皮5,酵母粉2.5,酪蛋白3,MgCl2.6H2O 3,KCl 1.5;发酵液比酶活为166.20 U/mL,较优化前提高了约56%。     

重组大肠杆菌发酵生产β1-3,1-4-葡聚糖酶培养基优化研究

通过对重组E.coliJM109发酵生产β1-3,1-4-葡聚糖酶条件的研究,发现培养基中氮源含量是影响β-葡聚糖酶产量的主要因素。优化后的培养基组成为:酵母粉12 g/L,甘油6 g/L、NaCl 10 g/L,NaNO37.21g/L,KH2PO42.4 g/L,K2HPO412.5 g/L。优化条件下,发酵30h,β-葡聚糖酶活力达到297.71 U/mL,约为初始时的14.3倍。     

根霉cw-1产纤溶酶的发酵条件优化

目的:确定根霉cw-1高产纤溶酶的液体发酵培养基组成及培养条件,使纤溶酶产量得到明显提高。方法和结果:采用响应面法对该菌种产纤溶酶的发酵条件进行优化。首先利用Plackett Burman试验设计筛选出影响产酶量的3个主要因素,即麸皮的浓度、豆粕的浓度和初始p H。在此基础上使用Design-Expert软件进行Box-Behnken试验设计,通过响应面分析得出菌株cw-1发酵产酶的最佳条件为:麸皮28.67g/L、豆粕46.28g/L、初始p H 5.8。经过试验验证,优化后粗酶液酶活达到243.22 U/m L(尿激酶单位),与响应面预测结果一致,较优化前酶活提高41倍。     

CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对大肠埃希菌所产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）进行基因克隆和重组表达,探讨其特性。方法以产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌12号菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CTX-M-14,将其克隆入pUCm-T Vector载体后测定该核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体pET-28α,构建含CTX-M-14基因的重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定表达的酶蛋白后再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠埃希菌BL21转化pET-28a／CTX-M-14重组质粒后,ESBLs试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量大约为30KD。结论成功表达重组的CTX-M-14型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

小麦全蚀病菌胞外β-1,3-葡聚糖酶的产生和部分特性的研究*

本文就小麦全蚀病菌胞外-1,3-葡聚糖酶的产生和部分酶学特性进行了研究。结果表明,小麦全蚀病菌能够产生胞外-1,3-葡聚糖酶。在供试的三种培养基中,最佳产酶培养基为改进的MS培养基。当以改进的MS为基础培养基时,最佳碳源为麦麸皮;最佳氮源为牛肉浸膏;产酶的最适条件为培养基初始pH为6,培养温度为26℃,250ml三角瓶中装培养基量为50ml时接菌量为4块菌饼(直径5mm)。另外,对酶的部分性质的研究结果表明,酶最适作用温度和pH分别为60℃和7.0,在50℃以下以及pH 5.5～7.5范围内稳定。     

重组Bacillus subtilis产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵优化

利用本研究室已构建的重组菌Bacillus subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase对产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵产酶进行了优化,考察了培养基中重要成分:碳源、有机氮源、无机氮源、有机与无机氮源质量比、碳源与氮质量比、金属离子种类等单因素对该重组菌产α/β-CGTase的影响,并采用正交实验对发酵培养基进行优化,对优化结果分析可知,重组菌B.subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase发酵产α/β-CGTase的最优培养基成本为:葡萄糖5 g/L,氮源(鱼骨蛋白胨∶NH4Cl=3∶1)25 g/L,1 mmol/L Mg^2+。在最优条件下发酵培养,α/β-CGTase的酶活由原来TB发酵培养基的9.20 U/mL提高至20.32 U/mL,是优化前酶活的2.2倍,为α/β-环糊精葡萄糖基转移酶的工业应用提供了理论支持。     

小麦全蚀病菌胞外β-1,3-葡聚糖酶的产生和部分特性的研究

本文就小麦全蚀病菌胞外-1,3-葡聚糖酶的产生和部分酶学特性进行了研究。结果表明,小麦全蚀病菌能够产生胞外-1,3-葡聚糖酶。在供试的三种培养基中,最佳产酶培养基为改进的MS培养基。当以改进的MS为基础培养基时,最佳碳源为麦麸皮;最佳氮源为牛肉浸膏;产酶的最适条件为培养基初始pH为6,培养温度为26℃,250ml三角瓶中装培养基量为50ml时接菌量为4块菌饼(直径5mm)。另外,对酶的部分性质的研究结果表明,酶最适作用温度和pH分别为60℃和7.0,在50℃以下以及pH 5.5～7.5范围内稳定。     

小麦全蚀病菌胞外β—1，3—葡聚糖酶的产生和部分特性的研究

本文就小麦全蚀病菌胞外β—1,3-葡聚糖酶的产生和部分酶学特性进行了研究。结果表明,小麦全蚀病菌能够产生胞外β-1,3-葡聚糖酶。在供试的三种培养基中,最佳产酶培养基为改进的MS培养基。当以改进的MS为基础培养基时,最佳碳源为麦麸皮;最佳氮源为牛肉浸膏;产酶的最适条件为培养基初始pH为6,培养温度为26℃,250ml三角瓶中装培养基量为50ml时接菌量为4块菌饼(直径5mm)。另外,对酶的部分性质的研究结果表明,酶最适作用温度和pH分别为60℃和7．0,在50℃以下以及pH=5．5～7．5范围内稳定。     

泡盛曲霉CAU33固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵条件优化

利用单因素实验法优化了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CAU33利用农业废弃物固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。产酶的条件包括碳源种类、初始水分含量、氮源种类、初始p H、表面活性剂、培养温度和发酵时间。进一步运用响应面分析法优化了其中主要因素,得到最佳产酶条件为:啤酒糟为碳源、含水量为81.6%、吐温60添加量20g/L、大豆蛋白胨添加量25g/L、自然p H、35℃下培养6d。在优化后的发酵条件下,最大产酶水平达到40 832.9U/g。泡盛曲霉固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力高,工业化生产和应用潜力大。     

β-葡聚糖酶和木聚糖酶高产菌株的选育及在小麦加工中的应用

以Aspergillus nigerJ5为出发菌株,经Co60γ-射线诱变,筛选到一株β-葡聚糖酶和木聚糖酶活力都较出发菌株高的突变株A-25,其产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的合适发酵条件为:大麦粉4%、玉米浆2.5%、NaNO30.4%、Na2HPO40.1%、MgSO4.7H2O0.03%、FeSO4.7H2O0.01%、CaCO30.5%、吐温-800.25%,初始pH6.7,300mL三角瓶的装液量为50mL,在此条件下培养84h,β-葡聚糖酶活力达到1203.9I U/mL,较出发菌株提高35.9%,木聚糖酶活力达到395.2I U/mL,较出发菌株提高27.8%。突变株粗酶液降解工业面粉非淀粉多糖的能力明显高于出发菌株。     

补料发酵法制备β-葡萄糖苷酶的研究

研究了黑曲霉制备β-葡萄糖苷酶液态发酵过程中添加麸皮和纤维二糖的补料工艺.补料量及补料次数影响着β-葡萄糖苷酶的分泌.经过四次补加1%菌麸皮干粉,发酵液中β-葡萄糖苷酶活力由未补料的1.72 U/mL增加到5.07 U/mL,提高了近3倍.而且,添加麸皮浸提液能达到同样效果.采用分批补料工艺产酶时,初始浓度为3%的麸皮用量比较适宜,其蛋白含量和β-葡萄糖苷酶的活力均为最高,分别达到0.69nag,/mL和7.00 U/mL.在补料总量和补料次数相同的情况下,以递减方式补料效果最好,产酶达7.34 U/mL.补加纤维二糖对β-葡萄糖苷酶的分泌具有一定的诱导作用,在接种培养48h时补加0.2%纤维二糖比较适宜.研究表明,分批补料发酵有利于黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶,是一种很好的提高酶产量的方法.     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化*

芽孢杆菌是产甘露聚糖酶的优良菌株,首次研究芽孢杆菌固体发酵条件的优化。以天然麸皮作为基本原料,研究利用枯草芽孢杆菌WY34固体发酵生产β-甘露聚糖酶的发酵条件。最佳固体发酵培养条件为:麸皮5 g,初始水分含量71%,初始pH 7.0,接种量为2 mL,1%Tween-80,0.4 g魔芋粉,培养温度50℃。在最适条件下培养5 d,甘露聚糖酶酶活高达7,650 U/g干基,是未优化前酶活的2.78倍。     

枯草芽孢杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化

【目的】采用响应面法(RSM)优化枯草芽孢杆菌5 L发酵罐产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。【方法】利用Box-Behnken设计和方差分析。【结果】获得最佳发酵条件为:转速、通气量和培养基pH分别为500 r/min、1.05 vvm和5.08,发酵时间仅为22 h产β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达2 294.4 U/mL。【结论】实验结果表明响应面法优化5 L发酵罐发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件合理可行。     

大肠埃希菌高产AmpC酶的检测及耐药性分析

目的了解深圳市人民医院高产AmpC酶大肠埃希菌的存在现状及其耐药性。方法采用Tris-ED-TA纸片裂菌法检测148株大肠埃希菌的AmpC酶。用琼脂稀释法测定产酶株对11种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。结果 148株大肠埃希菌中6株检出AmpC酶,检出率为4.1%。所有产AmpC酶大肠埃希菌对亚胺培南敏感,MIC为0.12～0.25μg/ml;对头孢吡肟的MIC值也较低,为0.5～32.0μg/ml,仅1株耐头孢吡肟。所有产AmpC酶大肠埃希菌对头孢西丁耐药,MIC为32～128μg/ml;对氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸和哌拉西林/他唑巴坦等加酶抑制剂复合物耐药性较强。结论深圳市人民医院大肠埃希菌高产AmpC酶检出率为4.1%。产酶株对多种抗生素耐药性较高。     

黑曲霉固态发酵苹果渣产β-甘露聚糖酶的工艺优化

目的:对黑曲霉SL-08固态发酵苹果渣生产β-甘露聚糖酶的生产工艺进行优化,旨在探寻苹果渣的综合利用方式,降低β-甘露聚糖酶的生产成本。方法:采用Plackett-Burman试验设计和响应面法进行优化。结果:最佳培养基组成为苹果渣与棉粕1∶1(w/w)、尿素2%(w/w)、KH2PO40.1%(w/w)、初始含水率59%(w/w)、CaCl20.2%(w/w)、MgCl20.1%(w/w),30℃恒温培养48h,β-甘露聚糖酶酶活力可达539U/g干曲,比基础培养基提高了28.3%,达到了以豆粕与麸皮为生产原料时的产酶水平。结论:采用黑曲霉SL-08对苹果渣进行固态发酵是一种有效的生物转化方式,既可用于β-甘露聚糖酶的生产,取代豆粕与麸皮等常规原料,降低生产成本;也可以对苹果渣进行综合利用。     

2921株大肠埃希菌的临床分布与耐药分析

目的了解近五年来本院分离的大肠埃希菌(ECO)的临床分布和耐药性变化,为临床合理治疗大肠埃希菌引起的感染提供参考。方法采用VITEK-32全自动微生物分析系统,对2009-2013年分离的大肠埃希菌进行菌株鉴定和药物敏感试验,用WHONET 5.4软件进行耐药统计分析。结果 2009-2013年本院共分离出2 921株ECO,2009-2012年大肠埃希菌主要分离自尿液,平均占29.4%,2013年大肠埃希菌主要分离自血液,占27.6%;2011-2013年产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌平均检出率为70.1%,高于2009-2010年的平均检出率64.1%(P0.05);主要来源于普外科和ICU,分别占22.1%、18.4%;非产ESBLs大肠埃希菌对头孢替坦、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南的耐药率高于产ESBLs大肠埃希菌(P0.05),对本研究其他药物的耐药率,非产ESBLs大肠埃希菌低于产ESBLs大肠埃希菌(P0.05);产ESBLs大肠埃希菌对氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、氨苄西林/舒巴坦的耐药率均90%,非产ESBLs大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率70%。结论大肠埃希菌是临床常见致病菌,本市产ESBLs大肠埃希菌的分离率非常高,耐药问题十分严重,应加强合理使用抗菌药物管理,定期监测,控制耐药菌的产生,预防医院感染暴发流行。     

淀粉液化芽孢杆菌b-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达的优化

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒。比较了pEGX-4T-1-bgl在不同Escherichiacoli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E.coliBL21(DE3)中的表达效果。结果表明,E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%。对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.