微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

利用CRISPR/Cas9技术构建定点突变小鼠品系

CRISPR/Cas9技术是新近发展起来的对细胞和动物模型进行基因编辑的重要方法。本文利用DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重组(Homologous recombination, HR)依赖与非依赖的修复机制,建立基于CRISPR/Cas9核酸酶技术构建定点突变小鼠品系的技术体系。针对赖氨酸特异脱甲基化酶2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活关键位点对应的基因组DNA序列设计单一导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到Kdm2b基因发生移码突变的基因失活品系及关键位点氨基酸缺失的酶活突变型小鼠品系。此外,利用HR介导的修复机理,将黄素单加氧酶3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及对应的点突变单链寡脱氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修复模板共注射到小鼠受精卵雄原核。对F₀小鼠基因测序分析显示,成功构建了Fmo3基因移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的基因敲入小鼠,这些突变能够稳定遗传给子代。本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组依赖与非依赖两种DNA损伤修复方式,成功构建了特定位点突变的小鼠品系。     

低乙醛Lager型啤酒酵母研究进展

啤酒酵母是啤酒酿造的核心,对啤酒风味及风味稳定性具有重要影响。乙醛是影响啤酒风味和风味稳定性最重要的醛类化合物,是酒精饮料中引起人类致癌的物质之一,主要通过啤酒酵母的生物代谢产生,存在于啤酒发酵过程及成品啤酒中。因此,筛选或选育优良的低产乙醛啤酒酵母菌株将成为有效解决啤酒风味稳定性的途径之一。近年来,随着基因工程技术的发展及啤酒酵母基因组的不断阐明,人们对啤酒酵母菌种改良展开了大量的研究,以期解决啤酒酿造问题,改善啤酒质量。本文对采用传统方式及基因工程手段选育低产乙醛啤酒酵母的最新研究进展进行了综述。其中,对低乙醛啤酒酵母选育的手段及策略进行了讨论并对低乙醛啤酒酵母选育的研究热点及发展趋势进行了展望。     

猪腹部火器伤肠管穿透后继发性脑损伤变化

目的:观察腹部火器伤肠管穿透后继发性脑损伤的变化.方法:健康长白仔猪42头随机分为对照组以及伤后1h、2h、4h、8h、12h和24h组,实验组建立腹部火器伤肠管穿透模型后,观察实验组各时间点脑组织学和超微结构的变化.结果:伤后12h、24h组光镜下出现逐渐加重的神经细胞水肿、变性;电镜下8h、12h、24h组出现逐渐加重的内质网扩张、线粒体肿胀、溶解;对照组光、电镜下未见明显的损伤性变化.结论:腹部火器伤肠管穿透后导致继发性脑组织形态学变化,随着伤后时间的延长而逐渐加重.     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

ldlD-14细胞表达NCAM并控制其N-聚糖合成的细胞模型的建立

神经细胞黏附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM)是一类表达于神经元、胶质细胞、骨骼细胞以及自然杀伤细胞表面的糖蛋白。NCAM在细胞-细胞黏附及神经细胞迁移等过程中起着重要作用,也是用来研究多聚唾液酸(Polysialic acid,PSA)的模式蛋白。将来源于小鼠乳腺上皮细胞NMuMG中的NCAM基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),转染至中国仓鼠卵巢细胞突变株ldlD-14细胞中,通过抗生素G418筛选及蛋白质印迹法检测,得到过表达NCAM的永久转染细胞株。利用ldlD-14细胞的特性,通过在无血清的基本培养基中添加半乳糖与否可以轻易操纵NCAM分子上糖链的修饰,为后期研究糖基化对NCAM分子功能的影响提供工作基础。     

发酵食品生产用功能微生物的改良和发酵技术

发酵食品是利用微生物作用而制得的一类产品,在中国有着悠久的历史和丰富的内涵.发酵食品功能微生物是食品发酵体系中对产品品质和风味有重要影响的因素.发酵食品产业是中国传统的优势民族产业,与人民生活密切相关,是中华名族文化传承的重要载体.发酵食品以其良好的质地和风味,自古以来深受中国人民喜爱.现代科学研究证实发酵食品具有多种营养保健功能,引起了消费者和科研工作者的广泛关注①.但中国发酵食品产业总体发展水平较发达国家落后:缺少高性能菌株,发酵提取工艺落后;产品结构不合理,品种单调;发酵废液对环境的污染有待进一步解决等.     

构建高产谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究

根据同源重组的原理,将来源于啤酒酵母工业菌株G03的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)和筛选标记Kan取代质粒pRJ-5中18S rDNA内部约340bp的DNA片段,构建重组质粒pRKG。以pRKG为模版,PCR得到以18S rDNA为整合位点包含GSH1和Kan的基因片段18S rDNA::(Kan-GSH1)。用此片段转化啤酒酵母工业菌株G03,通过G418抗性筛选得到啤酒酵母工程菌。实验室小试表明,工程菌的谷胱甘肽含量比受体菌株提高16.6%,啤酒的抗老化能力得到了显著提高,而常规指标没有发生显著变化。连续传代5次后胞内GSH含量基本不变遗传稳定性良好。由于表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于受体菌株自身,是通过自克隆技术改造工业啤酒酵母的一次有益的尝试。     

腹部肠管火器伤后脑组织COX-2的表达与细胞凋亡的研究

目的:探讨猪腹部肠管火器伤后脑组织环氧化酶-2(COX-2)的表达与细胞凋亡之间的关系.方法:健康长白仔猪42头随机分为对照组以及伤后1h、2h、4h、8h、12h和24h组,实验组建立腹部火器伤肠管穿透模型后,用免疫组化图像分析法测定各组脑组织COX-2的表达,采用TUNEL法观察脑细胞凋亡情况.结果:腹部肠管火器伤后COX-2在脑组织中的表达随着时间延长而表达增强、细胞凋亡率也随之增加,24小时组COX-2表达最强、细胞凋亡率最高,各实验组COX-2的表达和凋亡率明显高于对照组(P<0.01),各实验组COX-2表达与凋亡率明显高于上一时间组,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),Pearson直线相关分析表明,COX-2的表达与细胞凋亡率均呈正相关,相关系数为0.857(P<0.01).结论:腹部肠管火器伤后脑组织中COX-2表达与脑细胞凋亡趋势一致,且二者密切相关,提示腹部肠管火器伤后COX-2可能通过调控各种凋亡因子来促进脑细胞凋亡,从而在继发性脑损害过程中起重要作用.     

通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性

应用基于易错PCR随机突变的体外分子进化技术,来提高淀粉液化芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到3株热稳定性明显提高的突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18min)提高4min、13min和17min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min)、304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76mg/mL、6.19μmg/mL和6.84mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,3个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R)、2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。