重组人淋巴毒素随机点突变组合文库的构建

构建重组人淋巴毒素（rhLT）随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。应用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法分别对rhLT 的46、106和130位氨基酸进行定点随机突变,获得各单点随机突变体库。通过基因操作将这三个单点随机突变体库拼接并克隆于Pmd_18T载体建立三点组合突变体文库,DNA测序鉴定突变位点的随机性和多样性,原核表达该变异体库,体外测定生物学活性。成功获得rhLT三点随机点突变组合文库,其转化克隆数达到1.5×10⁵,是多样性理论值的4.5倍。50个样品的序列分析显示各个位点的核苷酸和氨基酸序列的突变都呈随机性分布。对原核表达的30个样品进行生物学活性测定,结果70%(21个)的样品无活性、23.3%(7个)的样品活性低于rhLT、6.7%(2个)的样品活性高于rhLT。成功构建了rhLT随机点突变组合文库,该库不仅在一级结构上具有良好的随机性和多样性,而且具有生物学活性的多样性,为应用噬菌体展示等高通量筛选策略对淋巴毒素进行体外分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础。     

冬小麦丙二烯氧化合酶基因(TaAOS)的克隆及其特性

丙二烯氧化合酶(allene oxide synthase,AOS)是茉莉酸脂加氧酶合成途径过程中的第一个酶.从冬小麦(Triticum aestivum L. cv.Jinghua No.3)克隆到了该酶的一个全长cDNA片段,其开放阅读框长约1 410 bp,编码一约含470个氨基酸残基的多肽,推测其分子量为51.9 kD.Southern分析显示其在基因组中以3个拷贝的形式存在.Northern杂交分析表明该基因表达可被外源的茉莉酸诱导,诱导10 h时达到高峰,进一步的RNA原位杂交表明该基因优先在幼叶中,尤其是在维管束附近的薄壁细胞中表达.同时,原位杂交还显示质膜钙通道的抑制剂La3 并不能抑制外源茉莉酸诱导该区域TaAOS的表达.     

茉莉酸作用的分子生物学研究

茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯等统称为茉莉酸盐,是广泛存在于植物中的一种生长调节物质,在植物细胞中起着非常重要的作用。介绍了茉莉酸生物合成过程中关键酶基因的克隆、表达及调控,并对茉莉酸的一些突变体进行了分析,结果 显示茉莉酸在发育及防御尤其是在雄性不育及抗病虫害方面起着非常重要的作用,同时综述了茉莉酸信号转导的最新成果。     

茉莉酸作用的分子生物学研究

茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯等统称为茉莉酸盐,是广泛存在于植物中的一种生长调节物质,在植物细胞中起着非常重要的作用,介绍了茉莉酸生物合成过程中关键酶基因的克隆、表达及调控,并对茉莉酸的一些突变体进行了分析,结果显示茉莉酸在发育及防御尤其是在雄性不育及抗病虫害方面起着非常重要的作用,同时综述了茉莉酸信号转导的最新成果。     

叶面喷施茉莉酸甲酯对马铃薯微型薯生长及产量的影响

以‘云薯505’马铃薯(Solanum tuberosum ‘Yunshu 505’)为材料,测定马铃薯块茎发育初期四个阶段茉莉酸含量,并以叶面喷施方式,研究茉莉酸甲酯对马铃薯生长和块茎产量的影响。结果表明,马铃薯块茎膨大过程中,茉莉酸的积累水平不断升高。在微型薯生产中,使用100 μmol·L^-1茉莉酸甲酯在结薯期以不同频率喷施叶面,测量并统计植株、块茎性状及产量变化。结果表明,与对照(CK)相比,1次·d^-1处理茎粗增加36.1%,2次·d^-1处理的叶绿素含量降低20.1%。此外,植株的叶色、茎色、花色、株型等生长性状及块茎大小整齐度、薯形、皮色、肉色、薯皮类型、芽眼深浅、裂薯率、大薯空心率等块茎性状在各组间没有显著差异。2次·d^-1、1次·d^-1、1次·2d^-1、CK四种处理的植株存活率分别为45.57%、100.00%、100.00%、87.29%;前三种喷施频率处理折合产量较CK分别增加-15.61%、8.77%、12.11%。综合分析,马铃薯在块茎形成初期茉莉酸积累水平不断升高,以1次·2d^-1频率叶面喷施100 μmol·L^-1茉莉酸甲酯,马铃薯微型薯的产量增加最大且不影响生长。     

头孢西丁耐药肺炎克雷伯菌AmpC基因和ESBLs检测及耐药性分析

目的了解深圳地区头孢西丁耐药肺炎克雷伯菌头孢菌素酶(AmpC酶)基因型分布、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的情况及其耐药特点。方法收集深圳地区三家大型综合医院临床标本分离对头孢西丁耐药的肺炎克雷伯菌73株。用碱裂解法提取菌株的质粒,采用多重PCR扩增AmpC基因,应用DNA测序确定其基因型。并对所有菌株进行ESBLs表型确证试验;用K-B法对其进行药物敏感试验。结果 48株(65.8%)AmpC基因扩增阳性,经DNA测序显示,其中46株为DHA-1型,1株为CMY-2型,1株同时产DHA-1和CMY-2型;73株肺炎克雷伯菌中49株ESBLs阳性,其中36株AmpC基因和ESBLs均为阳性。AmpC和(或)ESBLs阳性菌株对多数药物的耐药率高于AmpC和ESBLs均阴性者。结论本地区头孢西丁耐药肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶检出率高,基因型主要为DHA-1,同时产AmpC酶和ESBLs菌株较常见。     

渐狭叶烟草组培苗生根条件优化及在基因转化中的应用

针对渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)组培苗生根困难的问题，本研究测试了不同浓度萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)、嘧啶醇、矮壮素、生根粉及活性炭等外源添加物对组培苗生根的影响。结果表明，对照处理的组培苗在90 d内基本不生根；不同浓度矮壮素处理也不能诱导组培苗生根；而合适浓度的NAA、IBA或IAA处理均能较好地诱导组培苗生根，其中0.8 mg·L^-1 IBA不仅具有较好的诱导生根效果，生根率达72.73%，且根及地上部分均生长良好。进一步测试发现0.8 mg·L^-1 IBA处理对转基因组培苗具有良好的生根效果，20 d后生根率达60%以上，而对照组未生根；经伤口诱导和0.8 mg·L^-1 IBA处理，40 d内总生根率可达90%以上。该研究为高效获得渐狭叶烟草转基因生根苗提供了解决方案，也为渐狭叶烟草作为烟草属模式植物的研究提供了便利。     

营养补偿和代谢控制提高连续灌注培养重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc的蛋白产率

为解决连续灌注培养产物因营养物质不能有效利用而导致产率偏低的问题,降低生产成本,我们通过在发酵过程中测定表达重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc（TNFRp75:Fc）蛋白的CHO工程细胞株对氨基酸成分的不同消耗速率,定量添加特定氨基酸作为营养补偿,提高了培养基中氨基酸的综合利用效率;同时,在连续灌注过程中通过对葡萄糖补加的限量控制,使培养体系中葡萄糖始终低于0.5 g/L,减少了乳酸蓄积对细胞的毒性作用,从而有效降低了灌注速率。结果显示,在30L工作体积发酵规模上经过氨基酸补偿和葡萄糖控制的连续灌注培养工艺使最终重组蛋白产率（mg/L）和最终产量较工艺改进前提高了2.1倍和3.7倍,分别达到388mg/L和244.4g,生产周期延长了一周。工艺改进前后重组蛋白的唾液酸含量和体外生物比活没有改变。通过营养补偿和代谢控制工艺策略可以有效提高连续灌注培养工艺重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc蛋白的产率和产能,从而降低产业化成本。     

426株凝固酶阴性葡萄球菌临床分布及耐药性分析

目的:分析凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的分布及耐药性,为临床合理应用抗菌药物提供理论依据.方法:对我院2005年1月-2007年12月临床分离的CNS采用琼脂纸片扩散法(K-B法)检测药敏.结果:在426株CNS中共分离13种菌,其中表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌分别为218株、103株、46株,各占51.17%、24.18%和10.80%;CNS对氟霉素、阿米卡星的耐药率小于25%,对万古霉素和替考拉宁的耐药率为0%;对青霉素、笨唑西林、红霉素、头孢西丁、哌拉西林、庆大霉素和环丙沙星的耐药率大于50%.从CNS中检出的耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)和甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌(MSCNS)分别为350株和76株,分别占82.16%和17.84%;MRCNS对多种抗菌药物耐药,与MSCNS相比差异有显著性统计学意义(p＜0.01).结论:需要加强量CNS病原学耐药性监测,了解其分布特点,及时向临床反馈公布,为临床医师合理应用抗菌药物提供依据.