重组腺病毒介导人野生型P53和B7-1基因在喉癌细胞中的高效转移和高水平表达

为开展肿瘤的复合基因治疗,构建以串联方式携带人野生型p53和B7-1基因的重组腺病毒穿梭质粒pXC53/B7-1。将pXC53/B7-1与腺病毒包装质粒GT4050共转染293细胞,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒Ad-p53/B7-1。在293细胞中扩增病毒,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒,获得高滴度稿纯度的病毒,分别经免疫组织化学分析和流式细胞分析检测Ad-p53/B7-1介导的人野生型p53和B7-1基因在喉癌细胞ep-2中的表达。结果表明Ad-p53/B7-1能够有效地将其所携带的目的基因导入Hehp-2细胞并使其在细胞中高效表达。     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

重组p16腺病毒的构建及其对人白血病细胞的抑制作用

为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及野生型 p1 6基因的抗肿瘤特性 ,构建了复制缺陷型重组 p1 6腺病毒 .首先将 p1 6全长 c DNA插入穿梭质粒 p Ad CMV产生重组质粒 p Ad-CMV- p1 6,然后通过脂质体介导与 p JM1 7共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生 E1区缺失的重组腺病毒空斑 .用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株 HL- 60后 ,PCR及 Western blot分析显示在感染细胞中有外源性 p1 6 c DNA存在和 p1 6蛋白表达 ;被感染的 HL- 60细胞的生长受到明显抑制 ,而未感染细胞及对照腺病毒感染的细胞没有受到抑制 .结果表明 ,腺病毒作为一种新型基因转移载体 ,可有效地介导肿瘤抑制基因 p1 6的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景 .     

表达O型口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒构建及其免疫原性分析

为构建表达O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒（Ad5）为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-OZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基因后插入到pDC316-mCMV-EGFP质粒,构建了能够表达FMDV-OZK93株衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-P12A3B3C。利用AdMaxTM腺病毒包装系统进行重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-OZK93的包装、鉴定及扩增;并感染人胚胎肾细胞HEK-293进行表达验证。将鉴定正确且高度纯化后的重组腺病毒肌肉免疫小鼠进行免疫原性分析。结果显示,rAdvP12A3B3C-OZK93在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达1×10^9.1 TCID₅₀/mL。间接免疫荧光和Western blotting结果均表明rAdv-P12A3B3C-OZK93在HEK-293细胞中表达了FMDV特异...     

重组腺病毒介导人野生型p53和B7-1基因诱导喉癌细胞凋亡并增强其免疫原性

为开展喉癌的复合基因治疗,观察共表达人野生型p53和B7-1基因的重组腺病毒Ad-p53/B7-1对喉癌细胞增殖及免疫原性的影响,检测到Ad-p53/B7-1介导的人野生型p53基因可抑制喉癌细胞增殖并诱导其凋亡,同时B7-1基因的导入可增强喉癌细胞的免疫原性基因修饰的癌细胞可刺激自体肿瘤浸润淋巴细胞增殖,并诱导外周血淋巴细胞形成对肿瘤具有特异杀伤性的细胞毒性T淋巴细胞。     

抗肿瘤药阿霉素诱导Wnt通路抑制因子的表达

研究抗肿瘤药阿霉素对Wnt通路抑制因子FrpHE(frizzled-related protein)和DKK-1(Dickkopf-1)表达的作用.将抗肿瘤药阿霉素加入到人肝癌HepG2(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)、人大肠癌(Lovo,含野生型p53)和人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变)细胞株中.以RT-PCR技术检测阿霉素对Wnt通路抑制因子FrpHE和DKK-1的表达调节作用,以流式细胞术检测在肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子β-catenin的表达.在加入阿霉素24h后FrpHEmRNA表达水平在人肝癌细胞(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)中与对照组相比表达水平显著增加.在人大肠癌细胞(Lovo,含野生型p53)和人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变型)细胞中,未见FrpHE mRNA表达.DKK-1mRNA表达水平在人肝癌细胞(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)、人大肠癌细胞(Lovo,含野生型p53)和人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变型)中与对照组相比表达水平显著增加.β-catenin的阳性细胞百分比强度和平均荧光量强度与对照组相比,表达水平降低.提示化疗药阿霉素能明显诱导抑制剂FrpHEmRNA和DKK-1mRNA的表达.     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

仙台病毒BB1株6个编码基因的克隆及表达

在仙台病毒BB1株全基因组序列测定的基础上,用反转录和PCR方法获得了核蛋白基因(N),磷蛋白基因(P),神经血凝素基因(HN),基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)和聚合酶蛋白基因(L)等6个编码基因全长克隆;测序结果表明,其序列与Genbank中登录的序列(DQ219803)完全一致。为了提供仙台病毒基因组载体拯救和包装所需的反式作用蛋白,将N、P、M、F、HN和L分别克隆到腺病毒穿梭表达载体pDC316上,将它们分别与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,获得了6种复制缺陷性重组腺病毒Ad5-N、Ad5-P、Ad5-M、Ad5-F、Ad5-HN和Ad5-L。酶切结果表明6种重组腺病毒穿梭质粒构建正确;用PCR方法证明所获得的6种重组腺病毒分别携带了上述6个编码基因;用重组腺病毒感染LLC-MK2细胞后用Western blotting和免疫荧光方法检测到了相应仙台病毒编码基因的表达。本研究为仙台病毒BB1株全长基因组的拼接和病毒载体包装系统组建打下了基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验

构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P1—2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy—1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—p12x3c和pAdcmy—p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行。PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

Adenoviral-mediated transfer of human wild-type p53, GM-CSF and B7-1 genes results in growth suppression and autologous anti-tumor cytotoxicity of multiple myeloma cells in vitro

Multiple myeloma (MM) remains incurable despite the use of high-dose chemotherapy and stem cell transplantation. However, immunotherapy is expected to offer long-term disease control, or even possibly a cure. We have previously demonstrated the suppressive effect of a recombinant adenovirus carrying human wild-type p53, granulocyte–macrophage colony-stimulating factor, and B7-1 genes (Ad-p53/GM-CSF/B7-1) on the growth of laryngeal cancer cells. In the present study, we evaluated the effects of an Ad-p53/GM-CSF/B7-1-modified myeloma cell vaccine strategy aimed to induce apoptosis and to augment the immunogenicity of MM cells. Both MM cell lines and purified primary myeloma cells were infected with Ad-p53/GM-CSF/B7-1. High expression levels of these three genes were confirmed separately by Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and flow cytometry. When wild-type p53, GM-CSF and B7-1 genes were introduced, the growth of MM cells was inhibited via enhanced apoptosis and the immunogenicity of tumor cells was augmented. The combinatorial effect of these three genes on inducing cytotoxic T lymphocytes (CTLs) was more evident than that of p53 individually or any combinations of two (p53 plus GM-CSF or p53 plus B7-1). Furthermore, significant proliferation of autologous peripheral blood lymphocytes (PBLs) and specific cytotoxicity against autologous primary MM cells were induced in vitro. These results suggest that myeloma cell vaccination co-transferred with p53, GM-CSF and B7-1 genes may be a promising immunotherapeutic approach against MM.     

多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人存活蛋白（survivin）-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素β链的核心片段CTP37区域融合基因的真核表达质粒,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法：通过基因合成和搭桥PCR技术构建含有Survivin2B主要T细胞表位区域、人和猴CTP37区域基因的融合基因2PAG,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI—Fc—GPI中,继而又将酶切后的sig2PAG-FC-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7．1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM／B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-2PAG-FC-GPI-GM／B7（简称pVAX1-2PFcGB）转染293T细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：2PAG融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX-IRES-GM／B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-2PFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pVAX1-2PFcGB,且在293T细胞中可以有效表达,为对该基因疫苗的后续功能研究奠定了基础。     

p53 cDNA的克隆及在CV-1细胞中的表达

构建了可在哺乳动物细胞表达人p53基因的重组质粒pSV2neo-p53,并通过脂质体lipofectin介导转染猴肾细胞CV-1,用新霉素类抗生素G418筛选出阳性克隆。用原位杂交法检测转化细胞中的p53 mRNA;用免疫组化ABC法证明转化细胞的胞核中有p53蛋白表达。     

人源细胞内物质转运调节分子ARFGAP1对细胞分泌功能的影响

 ARF GAP是重要的细胞内物质转运调节分子 .最近 ,在人胎肝 c DNA文库中发现一种新基因 ,其编码的氨基酸序列与大鼠的 ARF1 GAP有 32 %同源性 ,故将其命名为“ARFGAP1”.对ARFGAP1进行功能研究 ,利用分子克隆技术构建绿色荧光蛋白 (GFP) - ARFGAP1融合基因表达质粒 (p EGFP- C1 - ARFGAP1 ) ,经脂质体转染将其导入 COS- 7细胞瞬时表达 ,利用绿色荧光确定ARFGAP1的亚细胞定位 .结果显示 ,ARFGAP1位于细胞质部分 ,表达量高时 ,在核周高尔基体区聚集呈团块状或颗粒状 .构建真核表达质粒 pc DNA3.1 /myc- His- ARFGAP1 ,在 COS- 7细胞中表达 ,并用 ARFGAP1和分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)真核表达质粒共同转染 COS- 7细胞 ,发现ARFGAP1在细胞中过表达能部分抑制 SEAP的分泌 .结果证明 ,ARFGAP1对细胞的物质转运和分泌功能有调节作用 .     

二恶英反应增强子调控的虫荧光素酶报告基因质粒的构建

为加强二恶英类化学物质的快速筛选和半定量检测,我们构建了一在二恶英反应增强子调控下的虫荧光素酶报告基因质粒。二恶英反应增强子来源于pHAV质粒,MMTV启动子来源于pCatM质粒,上述两者连接后与虫荧光素酶载体连接,转染人HepG2肝癌细胞,以2,3,7,8四氯代二苯并二恶英(TCDD)诱导报告基因表达后检测虫荧光素酶活性。结果表明该质粒中虫荧光素酶的表达受二恶英反应增强子的调控,且在一定浓度范围内虫荧光素酶的活性与TCDD的量呈线性关系。研究显示该质粒转染的细胞株有望用于快速筛选及半定量检测二恶英,可进一步加强研究作为二恶英类化学物质监测的常规方法。     

Identification of genotoxic stress in human cells by fluorescent monitoring of p53 expression.

The tumor suppressor protein p53 is induced upon DNA damage essentially by post-translational regulatory mechanisms, which lead to a substantial increase of p53 levels. To exploit this essential property of p53, we developed a novel reporter system for monitoring accumulation and subcellular translocation of p53 protein, which is able to function as a simple test for detecting mutagenic and genotoxic stress in human cells. For this purpose, we constructed a plasmid with a specific translational TP53::EGFP gene fusion and selected stable transfected clones in the human cell line HEK293, in which p53 is functionally stabilized due to the expression of the transgenic adenoviral E1A oncoproteins. HEK293-TP53::EGFP clones may be used as a living cell system for monitoring not only of the induction of p53 protein in the cell, but also of its subcellular localization. Using this human reporter cell system, we examined levels of p53 by fluorescence microscopy and by FACS analysis following treatment with several classes of genotoxic and carcinogenic compounds. All tested DNA damaging agents caused a significant increase of intracellular p53-EGFP levels in a concentration-dependent manner. On the other hand, non-genotoxic carcinogens and stress conditions that cannot damage DNA were not able to induce p53-EGFP accumulation. The induction effect caused by genotoxic stress was found to be dependent on the endogenous p53 status, because it was not observed in p53-deficient cell lines. This corroborates the notion that p53 may be used as an universal sensor for genotoxic stress and demonstrates the usefulness of HEK293-p53-EGFP cells as a reporter system for identification of mutagens and genotoxic carcinogens in human cells by means of visualizing and monitoring intracellular p53 levels and localization.     

Effect of adeno-associated virus-mediated transfer of low density lipoprotein receptor gene on treatment of hypercholesterolemia

ＬＤＬＲｐｌａｙｓａｖｉｔａｌｒｏｌｅｉｎｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇｐｌａｓｍａｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ.ＫｎｏｃｋｉｎｇｏｕｔＬＤＬＲｇｅｎｅｃａｎｃａｕｓｅｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ.Ｐｅｒｓｏｎｓｗｉｔｈｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ(ＦＨ)ｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｏｈａｖｅｇｅｎｅｔｉｃｄｅｆｅｃｔｓｉｎＬＤＬＲｇｅｎｅ.ＩｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇＬＤＬＲｇｅｎｅｔｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｉｍａｌｓｗｉｔｈｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｃｏｕ…     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力

人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus).本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用.从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达.用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4.与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深.用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍.结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增.