区域效应－一个前列腺癌早期诊断的新思路

目前临床上有许多怀疑前列腺癌但穿刺阴性的病例,为了避免漏诊,多数患者必须接受重复穿刺。尽管部分患者经重复穿刺确诊为前列腺癌,而更多患者经过长期随访以及反复穿刺最终确诊为良性病变。近期研究证实,癌灶附近的组织学表现正常的组织中也可发生与癌灶相似的分子改变。因此,我们认为在前列腺癌的发生过程中存在区域效应。在这一理论指导下,选择适当的可反映前列腺癌区域效应的标记物,在穿刺阴性的标本中检出与癌灶相似的分子改变,就可以帮助临床医生在常规病理诊断之前,提前预测前列腺癌的发生。如果能够找到这样的标记物,并在大规模的诊断试验中证实其可行性,那么就可以极大地改善前列腺癌诊断的现状。     

萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc的构建及表达

目的:为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送,构建萤光素酶报告基因表达质粒p EE14.1-luc,并验证其表达。方法:从质粒p GL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc,克隆入p EE14.1载体,构建重组表达质粒p EE14.1-luc,瞬时转染293T细胞,采用Western印迹、流式细胞术和免疫荧光等方法对萤光素酶基因在体外的表达情况进行验证,并运用活体成像仪检测萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结果:经菌液PCR鉴定和测序验证,p EE14.1-luc与预期设计完全一致;流式细胞术检测luc阳性表达率为22.41%,免疫荧光检测可见绿色荧光表达,Western印迹检测在相对分子质量为62×103处显现目的蛋白条带;同时,利用活体成像技术也检测到萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结论:p EE14.1-luc表达质粒构建成功,为研究DNA疫苗体内表达机制和体内电穿孔递送条件优化奠定了基础。     

以VEGF及VEGFR2为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗的研究进展

肿瘤细胞通过刺激新生血管生成来满足对营养及供氧的不断增长的需求,因此,肿瘤组织生长对于新生血管形成的依赖性使得抗血肿瘤管生成已经成为肿瘤学基础研究与临床治疗领域中最吸引人的策略之一.在众多的促血管生成因子中,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR2(鼠和人中也分别称为Flk-1和KDR)对于与肿瘤生长、转移及复发相关的血管生成是至关重要的.此外,通过打破肿瘤组织自身介导的免疫耐受与逃避,主动免疫治疗已成为一种崭新的抗肿瘤治疗方法.通过将这两种策略联合应用,抗血管生成主动免疫治疗使得更加有效地抑制肿瘤血管生成成为可能.这种免疫治疗与抗血管生成的联合应用有望成为一种有良好前景的研究方案.本文总结了通过打破VEGF/VEGFR2信号通路实现的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗方面最新研究进展.本文讨论了旨在抑制血管生成的三种不同形式的抗肿瘤疫苗-细胞疫苗、蛋白质/多肽疫苗及基因/DNA疫苗,以及这一领域未来的研究方向.     

佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离

目的建立类风湿性关节炎（RA）动物模型;从炎性关节滑膜中分离成纤维样滑膜细胞（FLS）。方法应用热灭活结核杆菌H37Ra菌株与矿物油混合制备改良的佐剂,尾根部皮内注射Lewis大鼠诱导关节炎;剪取成功诱导关节炎大鼠的病变踝关节,从中剥离滑膜组织,充分剪碎后采用胶原酶消化法分离成纤维样滑膜细胞。结果成功诱导了大鼠关节炎,发病率为100%,发病时间有规律,组织学表现与RA相似;成功在体外培养了FLS并对其进行了鉴定,掌握了其生长形态和特征。结论成功制备RA动物模型并获得FLS,为今后RA发病机制探索和药物评价提供了良好的体内动物模型和体外细胞模型。     

大质粒DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定

目的:从多种大肠杆菌感受态细胞中筛选出适合该研究大分子质粒DNA疫苗的宿主菌,鉴定其达到中试要求。方法:将疫苗质粒pSVK-CAVA(14.7kb)转化4种大肠杆菌化学感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳实验检测质粒的形态结构。对基因工程菌进行生化检测,并通过连续传代法和酶切鉴定进行稳定性检测,同时将质粒DNA瞬时转染至293T细胞中检测质粒表达能力。选取质粒含量最高和稳定性最好的宿主菌作为原始种子分装冻存,将原始种子库扩大培养,逐级建立好主种子库和工作种子库即三级种子库。通过摇瓶培养实验在4种常用基础培养基中挑选出最适合质粒生产的培养基。结果:确定了XL-10 Gold作为质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌,基因工程菌传代稳定性和结构稳定性良好,质粒能在293T细胞中体外表达。筛选出TB培养基为基础培养基,质粒容积产量达到9.9mg/L,比LB培养基提高了接近1倍。结论:该研究筛选出大肠杆菌XL-10 Gold作为质粒DNA疫苗的宿主菌,解决了大质粒在常用宿主菌中不稳定的难题,并对基础培养基进行了初步优化。     

多拷贝异种化前列腺干细胞抗原融合基因片段的构建及真核表达

目的：构建一系列含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的多拷贝异种化融合基因片段,并分别在人胚肾293T细胞中表达。方法：通过重叠延伸PCR法合成单拷贝异种化PSCA基因片段PSCA1,随即应用同尾酶法将该片段串联形成2、3、4拷贝异种化PSCA基因片段PSCA2、PSCA3和PSCA4,并将上述4种基因片段分别插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建最终目的片段1～4拷贝异种化PSCA-Fc-GPI（即PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI）,随即分别将重组质粒pCI-PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI体外转染293T细胞,利用间接免疫荧光和流式细胞仪检测其表达情况。结果：测序证实PSCA1片段与设计一致,酶切鉴定证明目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪的检测结果显示,在293T细胞中1～4拷贝异种化PSCA融合基因片段均获得较好表达。结论：构建了目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI,为以PSCA为靶抗原的抗前列腺癌DNA疫苗的构建及功能研究奠定了重要基础。     

基因枪介导真核表达质粒转染体外培养的COS-7细胞系的实验研究

目的：建立基因枪子弹制备及转染体外培养COS-7细胞系的方法。方法：以亚精氨、氯化钙沉淀法制备子弹（DNA＋金颗粒）,利用原子力显微镜观察子弹制备情况;采用基因枪方法分别将真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP转染对照组和实验组COS-7细胞,转染后24h,利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达。结果：制备了基因枪子弹,DNA紧密包裹在金颗粒周围;基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP被转染入体外培养的COS-7细胞,转染后24h可检测到红、绿荧光,而对照组则没有荧光蛋白的表达。结论：国产新芝SJ-500型基因枪能够有效介导外源基因转移,基因枪转染的COS-7细胞能够有效表达报告基因。     

多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人存活蛋白（survivin）-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素β链的核心片段CTP37区域融合基因的真核表达质粒,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法：通过基因合成和搭桥PCR技术构建含有Survivin2B主要T细胞表位区域、人和猴CTP37区域基因的融合基因2PAG,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI—Fc—GPI中,继而又将酶切后的sig2PAG-FC-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7．1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM／B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-2PAG-FC-GPI-GM／B7（简称pVAX1-2PFcGB）转染293T细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：2PAG融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX-IRES-GM／B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-2PFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pVAX1-2PFcGB,且在293T细胞中可以有效表达,为对该基因疫苗的后续功能研究奠定了基础。