人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

β_2微球蛋白的微量测定和应用

β_2微球蛋白(简称β_2mG)分子量小,因电泳显于β_2区带而得名,广泛存在于人各种体液中,是免疫球蛋白和移植抗原的一个组成成分,在生物学、免疫学和医学中已日益受到重视。本室建立血清β_2mG 放射免疫分析法(RIA),方法简便、特异性、灵敏度和重复性符合要求,对研究β_2mG的生理代谢及临床上诊断肾脏、肝脏及血液系统疾病是一种有用的辅助指标。一、材料和方法 1.人β_2mG 的提纯肾移植急、慢性排异期患者尿液,经硫酸铵粗提和凝胶 G100 层析、DE52 离子交换层析,收集洗脱液,     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的人激活转录因子5（ATF5）的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在蛋白和mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高roTOR的转录和蛋白水平。结论：构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

二肽基肽酶-4抑制剂在我国2型糖尿病全程管理中的应用

中国糖尿病治疗领域面临严峻挑战,需要新的治疗手段进行全面管理.二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)抑制剂可改善胰岛细胞功能,促进胰岛素分泌,抑制胰高血糖素分泌,并且不增加低血糖发生和体重增加的风险.无论是饮食、运动控制不佳的基础上单药治疗,或是与二甲双胍、磺脲类药物、噻唑烷二酮类药物或胰岛素联合应用,DPP-4抑制剂均能持续有效地降低糖化血红蛋白、空腹和餐后血糖.DPP-4抑制剂与二甲双胍早期联合,在治疗机制上互补,成为2型糖尿病治疗的理想方案.本文对DPP-4抑制剂在治疗中国2型糖尿病人群的疗效和安全性研究进展做简要综述.     

慢病毒介导的mTOR敲低肝癌细胞株HepG2的构建及初步功能检测

目的:建立高效稳定的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,并对mTOR敲低的HepG2肝癌细胞株的功能进行初步检测。方法:构建了2条不同的人mTOR慢病毒siRNA载体pLenti-H1/mTOR siRNA,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染HepG2细胞;经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹,检测mTOR敲减效果及其下游基因c-myc、周期蛋白D1(cyclinD1)表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平的变化。结果:RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的pLenti-H1/mTOR siRNA能有效抑制mTOR基因的表达,敲低了mTOR蛋白水平,且沉默mTOR后其下游基因c-myc、CyclinD1的表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平降低。结论:构建了慢病毒介导RNA干扰mTOR表达载体,为进一步研究mTOR通路奠定了实验基础。     

人EYA3基因真核表达载体的构建及其活性检测

目的：构建带myc标签的人EYA3基因真核表达载体,获得myc-EYA3融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测。方法：采用PCR技术从乳腺文库中扩增人EYA3基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果：双酶切和测序鉴定表明,myc-EYA3真核表达质粒构建成功,转染ZR75-1细胞后成功表达;生长曲线实验结果表明,EYA3可促进乳腺癌细胞的生长。结论：构建了带myc标签的人EYA3基因真核表达载体,myc-EYA3能在乳腺癌细胞ZR75-1中表达,且能促进该细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在乳腺癌中的功能奠定了基础。