利用逆转录病毒RNAi载体抑制心肌成纤维细胞分泌纤维连接蛋白

心脏间质纤维化是心室重塑的最重要表现之一, 心肌细胞外基质的过度积聚在其中扮演着重要角色. 纤维连接蛋白是细胞外基质的重要成分之一, 它负责胶原之间的连接、细胞的黏附和增殖等. 纤维连接蛋白主要由心肌成纤维细胞产生. 由于导致心肌细胞外基质过度分泌的因素很多, 单独阻断某一上游途径很难完全抑制由其他途径导致的过度合成. 利用RNAi技术试图在细胞外基质合成的终末途径进行阻断以期达到更为有效的结果. 通过体外合成的双链RNA, 抑制了纤维连接蛋白在血管紧张素Ⅱ刺激下的过度表达, 进而构建带有H1启动子的逆转录病毒载体, 成功地实现了用可稳定表达的shRNA抑制纤维连接蛋白的过度分泌. 该载体也可作为今后进行基因功能快速分析和基因治疗的工具.     

重组p16腺病毒的构建及其对人白血病细胞的抑制作用

为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及野生型 p1 6基因的抗肿瘤特性 ,构建了复制缺陷型重组 p1 6腺病毒 .首先将 p1 6全长 c DNA插入穿梭质粒 p Ad CMV产生重组质粒 p Ad-CMV- p1 6,然后通过脂质体介导与 p JM1 7共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生 E1区缺失的重组腺病毒空斑 .用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株 HL- 60后 ,PCR及 Western blot分析显示在感染细胞中有外源性 p1 6 c DNA存在和 p1 6蛋白表达 ;被感染的 HL- 60细胞的生长受到明显抑制 ,而未感染细胞及对照腺病毒感染的细胞没有受到抑制 .结果表明 ,腺病毒作为一种新型基因转移载体 ,可有效地介导肿瘤抑制基因 p1 6的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景 .     

大鼠高亲和力二羧酸转运蛋白的克隆表达及细胞内定位

目的：克隆大鼠高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白（SDCT2）的全长cDNA，并明确其在肾小管上皮细胞内的定位表达情况。方法：从大鼠肾组织中提取总RNA，用带有8肽FLAG标签的PCR引物通过RT-PCR技术扩增出SDCT2全长基因并测序，将其插入真核表达载体中构建SDCT2真核表达载体，然后将它们转染到肾小管上皮细胞LLC-PKl中表达，并用激光共聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况。结果：扩增出2kb的SDCT2全长基因，Westernblot表明肋CT2基因在LLC-PKl细胞中得到了正确的表达；共聚焦显微镜分析显示正常SDCT2蛋白主要定位于细胞膜上，与生物信息学的预测结果一致；为了比较不同连接温度对重组DNA连接效率的影响，观察了3种连接温度下的转化效率，结果显示温度循环法的连接效率明显比其他2种常规连接温度要高。结论：高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白全长基因被成功克隆，其主要表达于肾小管上皮细胞膜上。     

绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒—脂质体介导,导入LLC-PKl细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP—hNaDC3的定位情况。结果显示PKGFP-C3空白质粒转染的LLC—PKl细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pKGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接至网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。     

多囊肾病小型猪肾脏组织中增殖和凋亡的改变

目的:观察ADPKD小型猪肾脏组织中细胞增殖和凋亡的改变。方法:使用PKD1基因敲除的小型猪模型,用Western blot和免疫组化方法检测肾脏组织中细胞增殖指标PCNA;增殖相关的mTOR信号通路分子(phospho-mTOR、phospho-p70S6、phospho-4EBP1)和ERK信号通路分子(phospho-PKA、phospho-MEK、phospho-ERK)的表达水平以及内皮细胞粘附分子CD31以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase 3的表达变化。结果:在ADPKD小型猪肾脏组织中,增殖指标PCNA表达显著升高。mTOR信号通路分子phospho-mTOR、phospho-p70S6、phospho-4EBP1水平明显升高,ERK信号通路分子中phospho-PKA、phospho-MEK、phospho-ERK水平明显升高。CD31表达明显升高,Bax/Bcl-2的比值以及caspase 3的表达水平显著升高。结论:本研究显示在ADPKD小型猪肾脏组织中,细胞增殖和凋亡信号通路明显激活。     

三种基因转导方法在不同代龄复制性衰老细胞中的比较研究

以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)为报告基因 ,检测腺病毒、逆转录病毒和脂质体对 2 0代和 33代WI 38细胞的转导效率、EGFP的表达强度、对细胞增殖能力和生物学行为影响 ,比较病毒及非病毒方法对不同代龄成纤维细胞 (WI 38)细胞基因转导的特性 .结果显示 :对 2 0代和 33代WI 38细胞,腺病毒转染效率均最高 ,逆转录病毒其次 ;EGFP表达强度腺病毒最高 ,逆转录病毒最低 ;各方法2 0代细胞转导效率及表达强度均高于 33代细胞 (P <0 0 5 ) .逆转录病毒对细胞繁殖和SA β gal染色没有影响 ,腺病毒和脂质体均能导致细胞增殖能力下降 ,SA β gal染色阳性率上升 ,尤以脂质体明显 (P <0 0 5 ) .表明逆转录病毒介导基因对WI 38细胞衰老进程几乎没有影响 ,且转导效率较高 ,适于衰老细胞转基因研究     

人SDCT2蛋白亚细胞定位信号分析

为了确定人高亲和力钠离子依赖性二羧酸共转运蛋白（high-affinity sodium-dependent dicarboxylate co-transporter, SDCT2,NaDC3）在细胞内的定位,构建了SDCT2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白表达载体,并转染肾小管上皮细胞LLC-PK1,激光共聚焦显微镜观察显示,SDCT2蛋白主要定位于细胞的基底侧膜上.同时将SDCT2-EGFP融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达,可见融合蛋白的绿色荧光仅分布在细胞膜上.为了进一步确定该蛋白质的亚细胞定位信号序列,将SDCT2基因的N端及C端分别缺失,并构建缺失突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,将它们转染到LLC-PK1中,观察SDCT2 缺失体在细胞内的分布情况.结果显示,N端缺失的SDCT2蛋白主要位于细胞质中,顶膜和基底侧膜上也有表达;C端缺失的SDCT2蛋白主要位于基底侧膜上,顶膜几乎没有表达,细胞质中表达很少.免疫组化结果也显示,SDCT2只表达于人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜.这表明SDCT2蛋白的N端序列对其亚细胞定位是必需的,人SDCT2蛋白的基底膜定位信号位于N端序列中.     

细胞周期抑制因子p19ARF对人二倍体细胞衰老的影响

为了探讨细胞周期抑制因子p19ARF对人二倍体细胞复制性衰老的影响, 构建了重组p19ARF真核表达载体, 并通过脂质体的介导将p19ARF基因转染到人二倍体成纤维细胞WI-38中过表达, 观察其对WI-38细胞衰老的影响. 结果发现与对照细胞相比, 在p19ARF基因导入后, 细胞中p53和p21的表达水平明显上调, 细胞传代数减少10~12代, 生长速率降低, 细胞周期阻滞于G₁期, 衰老标志物SA-β-gal染色阳性率上升, 线粒体膜电位下降, 细胞形态呈衰老细胞样变化, 这些结果表明p19ARF高表达可促进人二倍体细胞的衰老进程.     

粘膜接种疫苗研究进展

与注射疫苗相比,粘膜接种疫苗具有使用方便,免疫效果好,不仅诱导局部免疫应答,也诱导全身性应答等优点,故日益引起重视,近年已相继开发了多种粘膜疫苗及用于粘膜免疫接种的佐剂和载体,后者包括非活性颗粒载体及具有复制活性的减毒活疫苗株,它们可保护疫苗不被降解,增强人体的免疫应答水平。本文介绍了这方面的研究进展。     

EGFP/SDCT1融合蛋白表达、亚细胞定位信号分析、组织分布及电生理功能研究

从正常人肾中克隆低亲和力钠离子依赖二羧酸共转运蛋白 1(sodium-dependent dicarboxylate co-transporter 1, SDCT1, NADC1)全长基因, 并将其和N端及C端缺失突变的SDCT1基因分别插入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达载体中构建EGFP/SDCT1融合蛋白真核表达载体, 然后将它们转染到人肾小管上皮细胞HKC中表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位情况以确定其定位信号. 双重PCR分析证实融合基因已整合到细胞基因组中, Western blot显示融合基因已在细胞中得到表达. 共聚焦显微镜分析显示正常人SDCT1蛋白主要定位于细胞膜上, 与生物信息学的预测结果一致, 而C端缺失的SDCT1基因转染的细胞, 其绿色荧光位于细胞质, N端缺失基因转染的细胞, 其绿色荧光主要位于细胞膜上. 将体外转录的融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达并用双电极电压钳技术记录细胞跨膜电流, 结果在卵细胞膜上测定出了Na⁺内向电流. 免疫组化结果显示SDCT1主要表达于人近端肾小管上皮细胞的管腔侧, 而在远端肾小管、集合管、肾间质和肾小球中未见SDCT1的表达. 上述研究表明, 正常人SDCT1蛋白定位于近端肾小管上皮细胞的管腔侧膜上, SDCT1蛋白的C端部分对于其合成后的迁移及靶向定位是必需的, 人SDCT1蛋白的细胞膜定位序列可能位于其C端部分.