狂犬病病毒糖蛋白哺乳动物细胞稳定表达细胞系建立

试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR）,获得糖蛋白全长cDNA,连接在pMD18-T载体上,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构建了糖蛋白单一表达载体pICG,表达质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,在G418抗性压力下出现细胞克隆,通过PCR检测,确定启动子与糖蛋白基因在细胞基因组中共同整合。借助Western blot检测,证明所表达的糖蛋白与狂犬病抗血清有特异的反应性。采用间接ELISA法,筛选出3株高效表达糖蛋白的细胞株,分别命名为ICG1、ICG2、ICG3。     

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。     

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3（NF）(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体Lipofectamine^TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验

构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡCAV 2 CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体LipofectamineTM 2000 介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3 缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2 型腺病毒CAV 2 CGS。Western印迹试验表明,CAV 2 CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。     

乳铁蛋白肽基因的合成及其在动物乳腺中的表达

根据已发表的编码牛乳铁蛋白肽(LfcinB)25个氨基酸的mRNA序列,设计了4条用于合成牛乳铁蛋白肽全基因的引物,用重叠延伸PCR法合成149 bp的牛乳铁蛋白肽基因(包括牛乳铁蛋白信号肽序列、上下游酶切位点和终止密码子),并将此基因克隆到载体pI-B,获得了乳腺特异性表达质粒pI-BL,该质粒经生理盐水稀释后直接注入稳定泌乳期奶山羊和奶牛乳腺组织(注射量为400μg),以琼脂板溶圈法检测奶样抑菌活性。结果显示,注射后3~48 h,奶样有明显抑菌活性,其中3~9 h抑菌活性最高。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2及其E3区重组质粒pVAX-E3为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp-26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV\-9株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2-CGS(34.7kb).以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体Lipofectamine TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2型腺病毒CAV-2-CGS.Western印迹试验表明,CAV-2-CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白.初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体.     

利用泌乳乳腺鉴定真核基因表达的研究

为了找到一种新的可用于基因及其表达调控元件鉴定的方法,本试验以蚓激酶(LK)作为目的标志基因,分别构建了在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)和beta-酪蛋白启动子调控下的三种真核表达载体pICLK、pLLKSN和pIbLK。制备各重组质粒后,以泌乳期羊乳腺作为支持系统,在处于稳定泌乳阶段分别注射400~800μg重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁,检测纤溶活性。结果显示,蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达,注射后6~9h蚓激酶表达量达到高峰,并可持续至72h以上;不同表达载体间表达量略有变化,但无显著差异。这些结果表明,利用泌乳乳腺组织表达真核蛋白是鉴定真核基因表达快速有效的手段之一。     

重组逆转录病毒浓缩方法研究

选择含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ（Neor)的重组逆转录病毒载体,通过包装细胞进行包装,得到了含有重组逆转录病毒粒子的病毒溶液,该病毒溶液分别采用差速离心和滤膜截留两种方法进行浓缩,浓缩前,后的病毒溶液体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度。结果显示,差速离心法的浓缩效率要优于滤膜截留法的浓缩效率,其浓缩效率能达到34．5％。