人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGⅡ4、GGⅡ1和GGⅡ3等为主要的流行遗传型.为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成.以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGⅡ1、GGⅡ3、GGH4和GGⅡ7型衣壳蛋白基因进行了表达.结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒.重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰.这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础.     

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用。分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSN蛋白C端86-175氨基酸并用G1utathione SepharoseTM 4B亲和纯化。将纯化蛋白分别以0．4nmol和1．5nmol的剂量腹腔注射新生Balb／C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况。当注射0．4nmol GST-NSP4重组蛋白时,有1只小鼠发生-过性腹泻(1／6),给予1．5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性。本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用。     

一种经miniSOG标记的人腺病毒的制备

为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。     

我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型.为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8.用这些病毒感染Sf-9细胞后,检测细胞内Ca2+浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2+浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异.在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4.分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性.上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的.针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索.     

转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力

人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus).本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用.从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达.用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4.与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深.用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍.结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增.     

人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达

诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGII4、GGII1和GGII3等为主要的流行遗传型。为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成。以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型衣壳蛋白基因进行了表达。结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒。重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰。这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础。     

人腺病毒41型(HAdV-41)在293TE细胞中的形态发生研究

为研究人腺病毒41型(Human adenovirus type 41,HAdV-41)的形态发生过程,将其接种于293TE细胞,收获细胞制作超薄切片并染色,通过透射电子显微镜进行观察。结果显示HAdV-41可以通过非网格蛋白陷窝、网格蛋白陷窝及直接穿入的方式进入细胞;细胞微绒毛可参与HAdV-41进入细胞的过程;进入细胞的HAdV-41包裹于囊泡内、溶酶体内或游离于细胞浆内;HAdV-41最终以游离状态靠近细胞核核孔,并释放核糖核蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)进入细胞核;子代HAdV-41最先出现在细胞核内;在HAdV-41复制过程中出现纤维丝状包涵体、致密包涵体及条索状致密包涵体,包涵体结构与HAdV-41的形态发生过程有关;最终,HAdV-41以裂解细胞方式释放。本研究揭示了HAdV-41形态发生的部分过程,进一步丰富了HAdV-41的生物学信息。     

SARS-CoV在Vero细胞培养中的多形性特征

为揭示SARS相关冠状病毒(SARS-associated coronavirus,SARS-CoV)的复制特点,并探讨该病毒的致病机制,利用负染电子显微镜(EM)、超薄切片EM和免疫EM技术研究了SARS-CoV在Vero细胞上的形态学特征。结果显示,成熟病毒颗粒多为圆形或椭圆形,直径80~120nm,包膜上有放射状排列的纤毛样突起,长约20nm,基底窄。此外可见哑铃形、肾形及“钉子样”等多形性成熟病毒颗粒,这些颗粒能与病人恢复期血清和抗S蛋白抗体反应。细胞内病毒颗粒多位于包涵体内,呈显著的多形性,直径为20~400nm,其形状可分为:①圆形、肾形或椭圆形;②管样结构;③不规则形,如三角形、哑铃形等,另外可见一种特殊的分枝样颗粒。颗粒电子密度不一,有实心和空心两种,其中空心颗粒周边的电子密度高。还观察到螺旋形的病毒核衣壳结构。     

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定

为了明确抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Western blotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoV N蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位.结果显示(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoV N蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoV N蛋白的aa 30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoV N蛋白的aa 170-184.这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料.     

原核表达人41型腺病毒(Ad41) 蛋白 V及其抗血清的制备

摘要：目的 人肠腺病毒Ad41被称为难养腺病毒,其难以培养的特性可能与次要核心蛋白V（Ad41 protein V,pV）表达不充分有关。本研究拟表达纯化Ad41 pV抗原,免疫动物制备抗血清,为研究Ad41难养性机理打下基础。方法 以野生型Ad41基因组DNA为模板,PCR扩增pV,克隆到原核表达载体pET30a(+),测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达,固化金属亲和层析(IMAC)方法纯化,免疫BALB/c小鼠制备抗血清,将获得的抗血清用于Western blot检测Ad41感染各细胞系后pV的表达。结果 克隆得到包括完全编码区的pV基因,表达质粒转化BL21(DE3)菌株,使用1 m mol/L IPTG 37℃诱导4 h,pV以包涵体形式表达,或使用0.5 m mol/L IPTG 25℃诱导8 h获得可溶性表达。利用皮下多点注射包涵体的方法免疫小鼠,得到抗pV抗血清;使用纯化的可溶性pV作为抗原对抗血清进行了鉴定,表明该抗血清可用于Western blot检测。等量野生型Ad41感染293或293E12细胞（一株稳定表达Ad41 E1B55K基因的293细胞）后,pV在293E12细胞的表达明显高于293细胞。结论 成功克隆了Ad41 pV基因,表达纯化了重组蛋白,获得了可用于Western blot检测的抗血清,为进一步研究Ad41难养性机理打下了基础。