PCR介导的cDNA文库矩阵排列筛选方法

描述了一种快速、有效的ｃＤＮＡ文库筛选策略。其主要过程是将ｃＤＮＡ文库重组子进行矩阵排列,进而用特异引物进行ＰＣＲ逐级筛选以分离目的基因．     

SMAD4蛋白对胰腺癌细胞促调亡作用的研究

ＳＭＡＤ４蛋白在嗜甲醇酵母中表达后,纯化鉴定。将纯化产生与两株胰腺癌细胞株共同孵育,用ＤＮＡ序列梯图谱和ＴｄＴ末端标记两种方法考察了此蛋白对体外培育的胰腺癌细胞生长的作用。结果显示ＳＭＡＤ４对胰腺癌细胞株ＳＷ１９９０有明显的促调亡作用,而对胰腺癌细胞株ＣａｐａｎⅡ未见这种作用。     

大鼠肝再生过程中肝再生刺激物及其mRNA的动态变化

本实验先制备大鼠肝再生模型,在该模型中大鼠成活率达９５％以上,肝再生情况良好,适合于进行下一步的研究。随后,通过耐热性和肝细胞特异性的检测,初步认为从该模型中所提取的活性成分即为肝再生刺激物（ＨＳＳ）。用３Ｈ胸腺嘧啶核苷测定ＨＳＳ及其ｍＲＮＡ体外翻译产物的生物活性,结果表明二者在肝再生过程中均存在动态变化,但前者在肝部分（２／３）切除后７２ｈ活性最高,后者则在２４ｈ达高峰。这一结果为后续的分子克隆工作奠定了基础。     

肝再生增强因子的cDNA克隆、表达及表达产物的生物活性研究

以肝部分切除后再生肝组织为起始材料,利用RT-PCR扩增出大鼠肝再生增强因子（ALR）,亚克隆于pGEM-T载体,核苷酸序列测定证实为大鼠ALR;将ALRcDNA亚克隆于pBV220质粒,构建了原核表达栽体,并获高效表达菌株,特异表达蛋白占细菌总蛋白的15％,原核表达的ALR在体外缺乏促进大鼠原代培养肝细胞及SMMC-7721肝癌细胞DNA合成的活性,但在体内1／3肝部分切除模型中可刺激肝细胞DNA合成;ALR在生物学活性方面与肝脏刺激物（HSS）存在一定差别,ALR和HSS应是两种不同的活性因子．ALR还具有促肝损伤修复的作用,对其深入研究可能为临床治疗严重肝病提供有效的药物.     

Human augmenter of liver regeneration: molecular cloning, biological activity and roles in liver regeneration

The complete amino acid sequence of human augmenter of liver regeneration (hALR) was reported by deduction from nucleotide sequence of its complementary DNA . The cDNA for hALR was isolated by screening a human fetal liver cDNA library and the sequencing of this insert revealed an open reading frame encoding a protein with 125aa and highly homologous (87% ) with rat ALR encoding sequence. The recombinant hALR expressed from its cDNA in transient expression experiments in cos-7 cells could stimulate DNA synthesis of HTC hepatoma cell in the dose-dependent and heat-resistant way. Northern blot analysis with rat ALR cDNA as probe confirmed that ALR mRNA was expressed in the normal rat liver at low level and that dramatically increased in the regenerating liver after partial hepatectomied rat. This size of hALR mRNA is 1.4 kb long and expressed in human fetal liver, kidney and testis. These findings indicated that liver itself may be the resource of ALR and suggested that ALR seems to be an im-portant parac     

新型人肝再生增强因子的分子克隆及其性能研究

肝再生增强因子(ALR)是新近发现,存在于新生大鼠肝组织中的一种新的肝增殖刺激因子,其人源性对应序列未见报道.研究在克隆大鼠ALRcDNA的基础上,首次报道了依据cDNA序列推导的人ALR的氨基酸序列;将人ALR编码区cD-NA亚克隆于真核表达质粒pcDNAⅠ,转染cos-7细胞后,发现其表达产物具有促进HTC肝癌细胞增殖的作用;Northern杂交提示人 ALR mRNA比大鼠ALR mRNA大,约l.4kb,表明人ALR cDNA具有更长的非翻译区序列;除肝脏外,ALR mRNA在胸腺及肾等人胚胎组织中也有较高丰度表达;正常大鼠肝组织仅低丰度表达ALRmRNA,但 2/3肝部分切除后12h肝组织ALR mRNA表达明显增高,提示 ALR可能是一种重要的肝再生刺激因子.     

mRNA差别显示研究肝再生调控基因

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理. 得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,一例在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝. 这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973.     

重组腺病毒介导人野生型p53和B7-1基因诱导喉癌细胞凋亡并增强其免疫原性

为开展喉癌的复合基因治疗,观察共表达人野生型p53和B7-1基因的重组腺病毒Ad-p53/B7-1对喉癌细胞增殖及免疫原性的影响,检测到Ad-p53/B7-1介导的人野生型p53基因可抑制喉癌细胞增殖并诱导其凋亡,同时B7-1基因的导入可增强喉癌细胞的免疫原性基因修饰的癌细胞可刺激自体肿瘤浸润淋巴细胞增殖,并诱导外周血淋巴细胞形成对肿瘤具有特异杀伤性的细胞毒性T淋巴细胞。     

共表达人p53、GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒的构建

 为开展肿瘤的复合基因治疗 ,构建以串联方式携带人野生型p53、GM CSF和B7 1基因的重组腺病毒穿梭质粒pBB 1 0 2 .将pBB 1 0 2与腺病毒包装质粒GT40 50共转染 2 93细胞 ,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒BB 1 0 2 .在 2 93细胞中扩增病毒 ,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒 ,获得高滴度和高纯度的病毒 .分别经免疫组织化学分析、ELISA和流式细胞分析 ,检测BB 1 0 2介导的人野生型p53、GM CSF和B7 1基因在喉癌细胞Hep 2中的表达 .结果表明 ,BB 1 0 2能够有效地将其所携带的目的基因导入Hep 2细胞并使其在细胞中高效表达 ,表达高峰期为转染后 2～ 4d ,此后随时间递减 ,可持续 1 0d以上 .     

mRNA差别显示技术对肝再生调控基因的研究

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理。得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,其一在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝。这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973。