Sp1真核表达载体的构建及对USP22基因转录活性的影响

目的 克隆人sp1基因,构建真核表细胞达载体pVAX-Sp1,研究其对USP22基因转录活性的影响.方法 Trizol试剂快速提取人肝癌细胞株HepG2总RNA,经RT-PCR扩增Sp1基因序列,与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;pVAX1-Sp1与含USP22启动子的萤光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性表达.结果 测序及酶切结果显示重组质粒pVAX1-Sp1构建成功;高表达sp1可使USP22启动子的转录活性降低（P＜0.01）.结论 成功构建了sp1真核表达质粒,sp1对USP22启动子具有转录抑制作用.     

DEK真核表达载体的构建及其对p53启动子活性的影响

目的：构建DEK的pcDNA3-Flag表达载体,研究其对抑癌基因p53启动子活性的影响。方法：以乳腺文库为模板,PCR扩增DEK编码序列,克隆到pcDNA3-Flag载体,构建成pcDNA3-Flag-DEK,转染293T细胞,Western印迹鉴定peDNA3-Flag载体介导的DEK的表达,萤光素酶报告基因活性实验研究DEK对p53启动子活性的影响。结果：双酶切实验证实得到pcDNA3-Flag-DEK阳性克隆;Western印迹实验发现DEK在293T细胞内表达;转录活性实验表明在ZR75-1乳腺癌细胞中,DEK呈剂量依赖性抑制p53启动子的活性。结论：构建了DEK的真核表达载体,并发现此表达载体能在ZR75-1乳腺癌细胞中抑制p53启动子活性。     

乙型肝炎病毒核心启动子下游克隆入Teto序列后其在不同细胞系中转录活性的变化

目的:探讨将Teto序列克隆入乙型肝炎病毒核心启动子(Cp)下游后对该启动子在不同细胞系中转录活性的影响。方法:利用PCR从质粒pTL-8中扩增7个Teto序列,并将其克隆入T载体pMD19-T/Simple中,测序正确后将7个Teto序列亚克隆入pGL3-Basic/Cp萤光素酶报告基因质粒中Cp启动子的下游,以构建质粒pGL3-Basic/Cp/x7t。将能表达TetR的质粒pTL-8的萤光素酶编码基因切除后,与pGL3-Basic/Cp/x7t共转染肝癌细胞系HepG2、宫颈癌细胞系HeLa、绿猴肾细胞系COS-7、乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双萤光素酶检测系统检测萤光素酶在这些不同细胞系中的活性,以分析将Teto序列克隆入乙型肝炎病毒核心启动子下游后对Cp在不同细胞系中转录活性的影响。结果:构建了质粒pGL3-Basic/Cp/x7t,将其转染HeLa、COS-7、HepG2、MDA-MB-231和HT-29细胞后其相对萤光素酶活性分别为56.14、171.52、211.03、6.11和34.24。结论:将Teto序列克隆入Cp下游并不能明显提高Cp的转录活性,而且破坏了Cp的组织特异性转录活性。     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinxl基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

CYP7A1基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体构建

目的:克隆细胞色素P450 7A1(CYP7A1)基因启动子,构建以CYP7A1基因启动子为启动序列的双萤光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究CYP7A1基因转录调控提供有效筛选工具。方法:采用PCR方法克隆CYP7A1基因启动子序列,连接到pUC57载体中,双酶切后连接至萤光素酶报告质粒pGL3-Basic上,构建重组萤光素酶报告质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。结果:重组质粒经双酶切和测序,证实构建正确;pGL3-CYP7A1-promoter-luc质粒2、3转染HepG2细胞均具有显著性启动子活性,pGL3-CYP7A1-promoter-luc2转染24和48 h后经检测分别为对照组(pGL3-basic空载体)的13.1±2.8倍(P0.001)和23.3±2.9倍(P0.001);pGL3-CYP7A1-promoter-luc3转染24、48 h后,荧光响应值分别是对照组的8.4±1.6倍(P0.001)和22.1±1.9倍(P0.01),呈现强启动子活性。结论:构建了CYP7A1基因启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc,为后续深入研究药物对其调控作用机制奠定了基础。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。     

利用双萤光素酶报告系统研究FoxM1转录活性调控

目的:构建细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)启动子萤光素酶报告系统,用于转录因子FoxM1转录活性调控研究。方法:利用瞬时转染、实时荧光定量PCR及Western印迹,验证人胚肾HEK293细胞中FoxM1对Cyclin B1 mRNA的转录及蛋白表达的调节作用;利用PCR技术从人宫颈癌HeLa细胞基因组中钓取人源Cyclin B1的启动子序列,克隆至pGL3-Basic Vector中,构建含有Cyclin B1启动子的萤火虫萤光素酶报告质粒pGL3-Cyclin B1;通过瞬时转染、Western印迹及萤火虫/海肾萤光素酶双报告系统,研究c-Abl酪氨酸激酶对FoxM1转录活性的调控作用。结果:构建了Cyclin B1萤火虫萤光素酶报告系统,该报告系统可用于FoxM1转录活性研究;c-Abl酪氨酸激酶能够显著抑制FoxM1靶向Cyclin B1启动子的转录活性,且抑制作用依赖c-Abl的激酶活性。结论:pGL3-Cyclin B1萤光素酶报告系统可用于研究c-Abl酪氨酸激酶介导的FoxM1转录活性调节。     

稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立

目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。     

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。     

NFY和RFX1对人PNRC启动子的调控作用

探讨核因子Y（nuclear factor Y, NFY）和调节因子X1（regulatory factors that bind to the X box, RFX1）对人PNRC（proline rich nuclear receptor coactivator）基因的调控作用及机制.根据凝胶电泳迁移率变化实验,分析NFY和RFX1与PNRC启动子区域的结合.将含有NFY和RFX1的真核表达质粒(pCMV-NFY, pCMV-RFX1)和含有PNRC启动子的荧光素酶报告基因质粒共转染HepG2细胞,检测转染细胞的荧光素酶活性,并用RT-PCR和Western印迹检测PNR的表达情况.Quick-Change法对PNRC启动子区NFY和RFX1结合位点进行突变,将包含突变点的重组荧光素酶报告质粒与含有NFY和RFX1的真核表达质粒共同转染HepG2细胞,检测各组荧光素酶活性.结果发现,NFY和RFX1能与PNRC启动子区域特异性结合;转染pCMV-NFY和pCMV-RFX1可抑制PNRC启动子活性并下调PNRC在HepG2细胞中的表达;包含NFY和RFX1结合位点的突变质粒与pCMV-NFY和pCMV-RFX1共转染后,NFY和RFX1对PNRC启动子活性的抑制作用消失. 以上结果提示,NFY和RFX1能调控PNRC基因的表达,其机制是与PNRC启动子区域的特异性结合位点相结合,发挥其反式抑制作用.