口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。     

口蹄疫疫苗研究新进展

口蹄疫是世界性重大动物疫病之一.接种疫苗是预防该病的重要手段之一,而研制高质量、安全有效的疫苗.不但是决定疫苗免疫效果的关键,也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件.目前,除传统疫苗仍然在口蹄疫防控中扮演重要角色以外,国内外诸如亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、可饲疫苗和多表位疫苗等的研究和探索已全面展开,有望为口蹄疫的有效防控提供新的途径.     

口蹄疫病毒株AF72 VP3的结构模拟与分析

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增目的基因,PCR纯化产物与pGEM TEasy载体连接并转化JM109菌株,用凝胶电泳、PCR和Spe I/Sph I双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序.比对测序结果确定AF72 VP3的核苷酸序列,利用同源建模的方法建立AF72 VP3结构蛋白的3D结构,在此基础上,综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测AF72 VP3结构蛋白的B细胞抗原表位.分析表明,口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的(P＞0.05);而它们在氨基酸水平上的变异率差异显著(P＜0.05).该毒株与20株源于GenBank中的VP3氨基酸序列比对发现其保守区主要位于第1～24、24～35、36～42、45～56、65～122、124～172、177～210、211～219位.AF72 VP3结构蛋白三维空间结构可分为A、B和C 3个结构区域,蛋白呈现较规则的空间构象,其中18～23、30～44、60～75、113～124、130～142、193～220氨基酸区段是AF72VP3结构蛋白可能的B细胞抗原表位区域,该结果将为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供更有价值的参考信息.     

FMDV vp1基因在烟草中表达及转基因烟草的免疫效果

通过三亲杂交法,构建克隆有阿克苏(Akesu/58)O型口蹄疫病毒vp1基因的双元表达载体pBin FMDV VP1.采用农杆菌介导法转化NC89烟草叶盘,经卡那霉素筛选,共获得49株抗性植株.对抗性植株总DNA进行目的基因的PCR检测,有40株阳性植株.对阳性植株总RNA进行目的基因的RT-PCR检测,有21株阳性植株.将7株ELISA和Western-blot检测阳性植株叶片提取物分别与弗氏佐剂乳化,在0、15、30和45d腹膜腔接种Balb/C小白鼠,于第4次免疫后第9d进行血清抗体检测;第12d用10 4SM\-\{50\}LD的同源强毒进行攻击;攻毒后24h采血,通过乳鼠病毒血症试验判定攻击Balb/C小白鼠的发病和保护情况.结果表明双元表达载体pBin FMDV VP1构建正确;vp1基因转入NC89烟草并获得表达;7组中有2组Balb/C小白鼠血清抗体呈阳性,攻毒保护率分别为100%和63%.证明2株转基因烟草表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,所免疫的2组Balb/C小白鼠对同源强毒攻击有一定的抵抗能力.     

口蹄疫O/China/99毒株在不同宿主系传代的3A和VP1基因变异研究

利用RT-PCR法扩增了经不同宿主系(乳鼠、BHK21细胞、PK15细胞)连传不同代次的口蹄疫O/China/99毒株的3A和VP1基因,并进行了核苷酸和氨基酸序列分析.结果表明,该毒株经不同宿主系传至90代后,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点也较稳定;而非结构蛋白3A基因却在不同宿主和代次发生突变缺失;经BHK21细胞传代后未发生缺失;经PK15细胞传代,在70～90代之间在第254～313位出现缺失;经乳鼠传代,在60～70代之间在第265～300位发生缺失,并在以后的90代毒中仍在此位缺失.这与代表性猪源流行毒O/YUN/TAW/97和O/HKN/21/70的3A基因在第276～305位发生缺失有相同之处.     

HMCES蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中的复制

【目的】鉴定能够调控猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)复制的关键宿主蛋白。【方法】利用LC-MS/MS技术结合串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)，分析PEDV感染Vero细胞36 h后和未感染组的蛋白组学差异。鉴定筛选了114个显著差异表达蛋白，其中宿主胚胎干细胞特异性5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白(5-hydroxymethylcytosine binding,ES cell-specific protein,HMCES)显著上调。进一步构建HMCES真核表达质粒，通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测过表达HMCES对PEDV复制的影响；合成针对HMCES基因的特异性si RNA，利用Western blotting和RT-q PCR检测si RNA对HMCES表达的干扰效果及HMCES被干扰后对PEDV复制的影响。【结果】过表达HMCES能显著促进PEDV在Vero细胞中复制，并且复制水平随着HMCES的剂量递增呈现剂量依赖式增加；si RNA-341下调内源性HMCES表达进而抑制PEDV复制。【结论】H...     

口蹄疫病毒结构蛋白P1-2A及蛋白酶3C基因的转基因番茄对豚鼠免疫反应的初步研究

构建了O型口蹄疫病毒China99株结构蛋白P1-2A、非结构蛋白3C以及部分2B基因(P1-2X3C)的植物双元表达载体pBin438/P1-2X3C,通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得40余株抗性植株,对得到的抗性植株进行分子生物学检测,65%的再生植株PCR检测阳性;RT-PCR结果证实P1-2X3C基因在转基因番茄中能够有效转录;ELISA和Western blot检测表明转基因植株中表达的目的蛋白具有免疫反应性。转基因番茄叶片蛋白粗提液经肌肉途径免疫豚鼠,于第3次免疫后28d用100ID50/0.2mL的同源强毒攻击,结果表明口蹄疫病毒P1-2X3C基因的转基因番茄表达产物具有良好的免疫原性,豚鼠3免后血清效价可达1:64~1:128,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达3/5和5/5。     

表达O型口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒构建及其免疫原性分析

为构建表达O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒（Ad5）为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-OZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基因后插入到pDC316-mCMV-EGFP质粒,构建了能够表达FMDV-OZK93株衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-P12A3B3C。利用AdMaxTM腺病毒包装系统进行重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-OZK93的包装、鉴定及扩增;并感染人胚胎肾细胞HEK-293进行表达验证。将鉴定正确且高度纯化后的重组腺病毒肌肉免疫小鼠进行免疫原性分析。结果显示,rAdvP12A3B3C-OZK93在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达1×10^9.1 TCID₅₀/mL。间接免疫荧光和Western blotting结果均表明rAdv-P12A3B3C-OZK93在HEK-293细胞中表达了FMDV特异...     

口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。     

A型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力评价

【目的】研制A型口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)新型合成肽疫苗,为畜牧业减少经济损失。【方法】应用两种含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)AF/72株VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35]和3B[29-42]4个抗原表位的合成肽联合CpG寡聚脱氧核苷酸(5’-TCGCGAACGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3’)在豚鼠上进行了免疫效力评价。【结果】2.5μg/只的合成肽364能保护4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻击,灭活苗组获得完全保护,其他组的保护效力仅为3/5;保护效力最高的两组的外周血CD4+T淋巴细胞含量高达33.7%和36.6%,而其他组不超过27.7%,PBS组仅为18.1%。【结论】本研究筛选出一组免疫效力较好的口蹄疫A型合成肽疫苗,可以作为候选疫苗进行进一步评价。