抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

茶树CsCOR1基因的原核表达

将来自茶树的冷诱导基因CsCORI与pGEX-6p-1质粒上的谷胱甘肤-S-转移酶(GST)融合,构建为融合表达载体,最终实现了在0.8 mmol/L IPTC诱导下的原核表达,获得了36 kD的可溶性融合蛋白,为对CsCOR1基因功能的进一步研究奠定基础.     

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin2的原核可溶性表达及其抗真菌活性研究

Curcin2是麻疯树幼苗在真菌侵染、干旱及高低温胁迫下诱导产生的一种核糖体失活蛋白.采用分子克隆的方法,从麻疯树基因组中扩增到Curcin2成熟肽编码基因,分别连接到质粒载体pGEX-6p-1、pMAL-c5E上,转化大肠杆菌最终获得重组菌PGC(pGEX-6p-1-curcin2)和PMC(pMAL-c5E-curcin2).在不同温度、IPTG浓度、时间诱导下,Curcin2在重组菌PGC中均以包涵体形式表达,在重组菌PMC中主要以可溶性融合蛋白形式表达,且蛋白质的表达量与诱导条件相关.重组菌PMC表达可溶性curcin2的优化条件为:温度28℃,IPTG 0.3mmol/L,时间8h,此条件下目的蛋白占总蛋白表达量的30.6％,1L培养物中可获得19.74mg电泳纯的重组蛋白.重组蛋白可被MBP TrapTM HP柱亲和纯化并与curcin抗体发生抗原抗体反应.体外抗真菌活性实验表明,纯化后的curcin2融合蛋白有抑制真菌生长作用,且对小麦赤霉、油菜菌核的抑制作用强于curcin.此蛋白的获得为其相关功能的研究奠定了基础.     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

人Artemin cDNA扩增及表达

以人胎脑RNA为模板, 采用RT-PCR技术扩增人Artemin cDNA。序列分析表明, 扩增的人Artemin cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号：AF115765)同源性为99.7%, 氨基酸序列同源性为100%。将经过序列分析确定的Artemin cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中, 构建重组表达载体pGEX-6p-1-hART。通过SDS-PAGE分析重组人Artemin融合蛋白在大肠杆菌中的表达情况。结果表明, 重组人Artemin融合蛋白表达量约占宿主菌总蛋白的18.32%, 主要以包涵体形式存在。对表达的重组人Artemin融合蛋白包涵体进行溶解和复性, 并进行Western blotting分析。说明体外成功扩增人Artemin cDNA, 并在原核表达系统中高效表达了重组人Artemin融合蛋白。     

八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的

以八肋游仆虫第二类肽链释放因子eRF3基因为模板,用PCR的方法获得eRF3的C端(eRF3C)和C端缺失76个氨基酸的突变体eRF3Ct片段,并构建重组表达质粒pGEX-6p-1-eRF3C和pGEX-6p-1-eRF3Ct,转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达。通过Glutathione Sepharose 4B柱亲和层析纯化,重组蛋白GST-eRF3C和GST-eRF3Ct获得纯化。Western blotting分析表明获得的蛋白为目的蛋白。PreScission酶切割后得到eRF3C和eRF3Ct蛋白。体外pull down分析显示eRF3C和eRF3Ct均能与八肋游仆虫第一类释放因子eRF1a相互作用,这表明八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的。     

J亚群鸡白血病病毒AH09/2株的gp85基因的克隆与原核表达

利用PCR方法扩增出J亚群禽白血病病毒(ALV-J)AH09/2株的gp85基因全长930 bp DNA片段。经T载体克隆测序并连接到pGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-gp85,在IPTG的诱导下进行表达。Western-blot结果分析表明,gp85融合蛋白表达产物分子量大小约61 kDa,并能与ALV-Jenv基因单抗发生特异性反应。这些结果为深入研究GP85蛋白的生物学功能及研制ALV-J检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

游仆虫EoRab2a蛋白的表达、纯化及定位分析

Rab GTPase家族蛋白是真核细胞内膜系统转运途径中重要的调控因子,不同的Rab家族成员在细胞具有功能多样性。为了解Rab2的功能,八肋游仆虫EoRab2a基因连接入原核表达质粒pGEX-6P-1中,获得重组表达质粒pGEX-6P-1-EoRab2a。质粒pGEX-6P-1-EoRab2a转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,大肠杆菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EoRab2a高效表达了可溶性GST-EoRab2a蛋白。融合蛋白GST-EoRab2a经亲和层析获得电泳纯蛋白。纯化后的GST-EoRab2a免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。ELISA和Western blotting检测显示制备的抗体效价1∶25600,特异性良好。免疫荧光定位表明EoRab2a在游仆虫细胞质中点状分布,推测参与内质网与高尔基体间膜泡转运。       

犊牛前胸腺素α基因在大肠埃希菌中的表达及活性分析

以RT-PCR法扩增犊牛前胸腺素α基因(prothymosin-α,ProT-α),与原核表达载体pGEX-4T-1连接生成重组质粒pGEX/ProT-α,再将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导后表达的GST-ProT-α融合蛋白主要存在于细菌裂解液中。SDS-PAGE电泳表明,GST—ProT-α融合蛋白表达量较高,分子量为38 ku;Western-blot和动物细胞试验表明,该产物能与胸腺素α1抗体发生特异性免疫反应,并可显著提高小鼠脾细胞增殖率和NK细胞杀伤活性。     

耐辐射奇球菌pprM基因增强大肠杆菌氧化抗性的研究

目的:探讨耐辐射奇球菌ppr M基因对大肠杆菌氧化抗性的影响。方法:氯化钙法转化分别构建含pGEX-6p-1-pprM质粒的大肠杆菌DH5α。测定不同浓度过氧化氢对含pGEX-6p-1-pprM、pGEX-6p-1和野生型大肠杆菌DH5α活性的影响以及菌体内SOD/GSH/CAT水平的变化。结果:与空质粒组和野生型组相比,含pprM的大肠杆菌在同浓度过氧化性情况下,其抑菌圈明显缩小,差异有统计学意义。与空质粒组和野生型组相比,含pprM的大肠杆菌体内CAT活力、SOD活性明显提高,但GSH量并没有明显提高。结论:pprM基因能够提高大肠杆菌抗氧化能力,其机制可能与pprM基因增强细菌体内抗氧化酶的活性有关。     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化

利用PCR和基因重组技术构建了小嫌PC－1基因全长cDNA及其N端45个氨基酸残基的表达质粒pGEX-4T-1-mPC-1和pGEX-4T-1-mPC-1-45。经IPTG诱导后,在大肠杆菌DH5α中,GST－mPC-1和GST－mPC-1-45两个融合蛋白都获得了可溶性高表达。经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,获得了纯的GST－mPC-1和GST－mPC-1-45蛋白。     

一种制备口蹄疫抗原和高免血清的新方法

口蹄疫是一种一类传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV衣壳蛋白VP1含有中和性抗原表位。本研究合成了编码O型FMDVVP1蛋白中和性抗原表位的双拷贝DNA片段,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-1中,以获得的重组质粒转化大肠杆菌,然后用IPTG进行诱导,表达出了大小约为33kDa的GST融合重组蛋白,Westernblotting分析证实,重组蛋白可以被O型FMDV抗血清所识别。用纯化的重组蛋白免疫豚鼠制备高免血清,ELISA检测表明,免疫后的豚鼠血清抗体滴度可达1∶20560以上。本研究提供了一种制备口蹄疫抗原和高免血清的新方法。     

SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8的原核表达

以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。     

人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化

旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件。采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gi1α,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1α,测序无误后将融合基因与pFASTBac1重组得重组质粒pFASTBac1-GPR81-Gi1α,而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81- Ci1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件。结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件。该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81- Gi1α融合蛋白的制备。     

人泛素结合酶9的原核表达与纯化

目的:表达和纯化高纯度的人泛素结合酶9(hUBC9)。方法:将hUBC9基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上并转化大肠杆菌BL21(DE3),于30℃、1mmol/LIPTG诱导4h,表达GST-hUBC9融合蛋白。用Glutathione-Sepharose4B柱分离GST-hUBC9融合蛋白,用鼻病毒3C蛋白水解酶切去GST-hUBC9融合蛋白的GST标签,再用FPLC分子筛层析法进一步纯化hUBC9。结果和结论:获得了重组表达质粒GST-hUBC9并在大肠杆菌中可溶性表达,经亲和层析、酶切、分子筛层析后获得了可溶的、高纯度的hUBC9,为进一步研究hUBC9的功能和结构奠定了基础。     

肺炎链球菌中青霉素结合蛋白PBP3在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定

【目的】克隆肺炎链球菌R6的pbp3基因,构建原核表达载体并转化大肠杆菌表达,为PBP3的结构及应用研究创造条件。【方法】利用PCR法克隆肺炎链球菌R6中N端截短的pbp3基因(15-413 aa),BamHⅠ和XhoⅠ酶切后插入pGEX-6p-1构建pGEX-6p-pbp3*表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中胞内表达GST-PBP3融合蛋白,Glutathione-Sepharose 4B column亲和纯化GST-PBP3融合蛋白,PreScission Protease切除GST标签,再次过谷胱甘肽亲和层析柱获得纯化的PBP3蛋白。利用PBP3对头孢喹诺的结合试验来鉴定表达蛋白是否有活性。【结果】经测序鉴定成功扩增出N端截短的pbp3基因,成功构建了pGEX-6p-pbp3*表达载体,并纯化出可溶性PBP3蛋白,而且有活性。【结论】肺炎链球菌pbp3基因原核表达系统的成功构建以及有活性重组蛋白的获得,为PBP3蛋白的结构及应用研究奠定了基础。     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.