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诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。 相似文献
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引入CpG基序的汉滩病毒G2糖蛋白基因的克隆及表达 总被引:2,自引:2,他引:0
构建汉滩病毒G2糖蛋白的真核表达载体,并加入可增强小鼠免疫刺激作用的CpG基序,检测其可否在真核细胞中表达。参照Genebank中汉滩病毒M的全基因序列设计引物,引物两端引入可增强小鼠免疫刺激作用的CpG基序及双酶切位点,通过聚合酶链反应(PCR)获得含CpG基序的G2片段,并将其与T载体pMD18-T相连,测序后克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,将此真核表达载体以脂质体法转染至真核细胞Vero-E6中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现转染后的Vero-E6中出现特异性的绿色荧光。结果表明本实验成功构建了汉滩病毒包膜糖蛋白G2的重组体。 相似文献
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为了鉴定抑制麻疹病毒体外复制的靶向Rab9GTPase基因效应性小干扰RNA(siRNA),根据。iRNA设计原则和Rab9GTPase基因的mRNA序列,设计并化学合成8对靶向Rab9GTPase基因的siRNAs和1对阴性对照siRNA,经脂质体法转染Vero—E6细胞株,转染10h后感染麻疹病毒Edmonston株。通过逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测转染后细胞内Rab9GTPasemRNA水平;通过标准蚀斑试验检测麻疹病毒滴度。同对照组相比,8对靶向Rab9GTPase基因siRNAs中的2对(Rab9-4和Rab9—7),以时间和剂量依赖性的方式显著地抑制细胞内Rab9GTPasemRNA表达和麻疹病毒的复制(抑制率高达90%以上),其他的siRNAs对细胞内Rab9GTPasemRNA表达和麻疹病毒的复制的抑制性效应则低于50%。结果表明,Rab9-4和Rab9—7是体外抑制麻疹病毒复制的最有效的siRNAs,这些siRNAs靶序列能被用来深入研究RNA干扰治疗麻疹病毒感染的可能性。 相似文献
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构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。 相似文献
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构建Rab9 GTPase siRNA表达载体,观察siRNA对哺乳动物细胞内Rab9 GTPase表达的抑制作用,为应用Rab9 GTPase siRNA表达载体进行抗麻疹病毒感染研究奠定基础。根据Rab9 GTPase基因的mRNA序列设计合成2对靶向Rab9 GTPase基因的寡核苷酸,克隆到表达载体pSUPER.neo EGFP,通过双酶切和序列分析对重组表达载体进行鉴定。将鉴定为阳性的重组表达载体转染B95a细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)检测B95a细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白的表达水平。双酶切和序列分析表明成功构建了Rab9 GTPase siRNA表达载体,RT-PCR和Western-blot技术实验表明重组表达载体可显著抑制B95a细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白的表达(最高抑制率分别为89.4%±0.5%和87.6%±0.7%),而对照组则没有变化。结果表明,成功构建了Rab9 GTPase siRNA表达载体,该表达载体可有效地抑制Rab9 GTPase在哺乳动物细胞内的表达。 相似文献
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