人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化

旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件。采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gi1α,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1α,测序无误后将融合基因与pFASTBac1重组得重组质粒pFASTBac1-GPR81-Gi1α,而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81- Ci1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件。结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件。该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81- Gi1α融合蛋白的制备。     

孤儿G蛋白偶联受体hGPCRc的亚细胞定位及组织分布

利用相关生物信息学软件,对从人结肠组织克隆所得某一孤儿G蛋白偶联受体(orphanGprotein_coupledreceptors ,oGPCRs)成员hGPCRc的氨基酸序列进行分析显示,hGPCRc对应的氨基酸序列组成了七个跨膜区段的结构域,具备GPCR的结构特征;然后,将hGPCRc之cDNA与绿色荧光载体pEGFP-N₁ 构建GFP_hGPCRc表达载体,以空白质粒pEGFP-N₁ 作对照,转染CHO-K₁ 细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察到空白质粒pEGFP-N₁ 转染的细胞表达了GFP并均匀分布于整个细胞,而GFP_hGPCRc转染的细胞观察到荧光清晰聚集于细胞膜和各细胞器质膜上,因而hGPCRc蛋白定位于膜上并稳定表达,与软件分析结果相一致;最后,以RT_PCR检测hGPCRc在2 0周龄胎儿重要组织器官及部分成人组织中的表达情况,结果显示hGPCRc在人心、肾、小脑及结肠等组织均有表达,但在肝、大脑、小肠及肌肉等组织里未检测到表达。该表达谱对于进一步认识hGPCRc在胚胎发育中的作用及生理功能提供了线索。     

人孤儿受体GPR81分子克隆、组织分布及表达工程细胞株的建立

采用PCR技术分别从人全血基因组DNA及引产胚胎肾组织cDNA中扩增得到gpr81的全长cDNA序列(1041bp),运用生物信息学手段绘制该基因的分子进化树,显示该基因的氨基酸序列与烟酸受体同源性最高;然后,采用RT-PCR法分析该基因表达的组织分布,组织表达谱显示该基因在多种组织均有表达,以心脏及肝脏组织为最高;利用分子克隆手段构建含6×组氨酸(His)标签蛋白的真核表达载体pcDNA3·1(-)/his-myc-A-gpr81,通过脂质体介导,将该重组质粒转染CHO-K1细胞,RT-PCR证实该基因已整合入CHO-K1细胞的基因组中,Western-blot表明GPR81在CHO-GPR81工程细胞株中有表达。组织表达谱的检测和工程细胞株的建立为进一步研究该受体的生物学功能奠定了基础。