八肋游仆虫核糖体蛋白L11的基因克隆与序列分析

以单细胞真核生物八肋游仆虫Euplotes octocarinatus为实验材料,采用PCR、RT-PCR方法克隆了核糖体蛋白L11基因(EoRPL11).将该序列与GenBank中其他物种的RPL11基因序列进行同源性比对,采用DNAStar软件进行聚类分析.结果显示,成功克隆到游仆虫RPL11基因,大核中该基因全长709 bp,开放阅读框(ORF)为531 bp,编码176个氨基酸;cDNA序列与大核中ORF序列一致,表明该基因具有转录活性;所推导的氨基酸序列与嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila的RPL11同源性最高,为66%.     

应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

本研究旨在应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）小鼠（DCM小鼠）进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR,Q-PCR）检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%（P<0.0001）。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中转导出生后1天的DCM小鼠原代心肌细胞,Q-PCR检测结果表明CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA的敲低效率达到55%（P<0.01）。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,然后将200 μL 约1×1012 AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时,Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%（P<0.01）。对5月龄野生型（WT）、DCM（未注射病毒组）和AAV9+DCM（基因组编辑工具注射组）三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示：DCM小鼠的心脏形态异常,而AAV9+DCM小鼠心脏形态趋于正常;对三组小鼠的心脏进行超声心动图并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数（left ventricular percent ejection fraction,LV EF%）、左心室短轴缩短率（left ventricular percent fractional shortening,LV FS%）分别下降了50.4%（P<0.0001）,55.1%（P<0.0001）,而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升了66.5%（P<0.01）,77.0%（P<0.01）;通过Q-PCR和天狼星红染色检测三组小鼠的心脏纤维化程度,结果显示DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍（P<0.001）、4.5倍（P<0.01）,而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降了2.0倍（P<0.05）、1.4倍（NS）,天狼星红染色结果显示纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测三组小鼠的心脏心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平,结果表明DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍（P<0.01）,而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降下降2.8倍（P<0.05）,Nppa蛋白质表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变（gRNA 5T）和正常的TNNT2 mRNA（gRNA 5V）序列分别组合转染到293T细胞中,通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%（P<0.0001）,而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141W mRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。     

调节性T细胞参与调控新生小鼠心肌再生

为探究调节性T（regulatory T,Treg）细胞在新生小鼠心肌损伤后再生中的作用,首先建立新生小鼠心肌再生模型。C57BL/6J（C57）新生1 d小鼠20只随机分成2组。实验组进行心尖切除（apex resection,AR）,假手术（Sham,SH）组只进行开胸。术后7 d取心脏组织,利用在细胞核表达的增殖标志物磷酸化组蛋白H3（phospho-histone H3,pH3）和Ki67分别与在心肌细胞胞质特异表达的α-辅肌动蛋白（alpha-actinin cytoskeletal isoform,α-actinin）,进行免疫共染检测心肌细胞增殖。结果显示,与SH组相比,AR组pH3+及Ki67+的心肌细胞明显增多。而且Masson三色染色结果显示,术后21 d被切除的心肌组织完全再生。为研究Treg细胞是否参与调控新生小鼠心肌损伤后的再生,Western印迹检测Treg细胞特异转录因子叉头/翼状螺旋转录因子3（forkhead box P3,Foxp3）蛋白表达水平。结果显示,术后7 d、14 d,AR组心和脾中Foxp3与SH组相比显著升高（P<0.05）。同时,免疫组化染Foxp3结果显示,术后7 d、14 d, AR组与SH组相比,心尖处有大量的Treg细胞富集。为更直观地检测AR后Treg细胞的数目变化,利用流式细胞仪检测术后7 d Treg细胞数目。结果显示,AR组心和脾中Treg细胞数目与SH组相比显著增多（P<0.01）。为研究Treg细胞对AR后心肌再生的影响,引入注射白喉毒素（diphtheria toxin,DT）的Foxp3DTR小鼠,可特异性敲除Treg细胞。实时定量PCR结果显示,AR+DT组与AR+PBS组相比,抑炎因子白介素IL（interleukin,IL）-10、IL-13与转化生长因子TGF（transforming growth factor,TGF）-β表达均降低（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。而促炎因子IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）表达均升高（P<0.01,P<0.001,P<0.01）。免疫荧光染色检测结果显示,AR+DT组与AR+PBS组相比,术后7 d pH3+及Ki67+的心肌细胞明显减少;并且Masson三色染色结果显示,术后21 d AR+DT组被切除的心肌组织不能再生。综上所述,敲除Treg细胞会加剧AR后的炎症反应,抑制心肌细胞增殖,最终导致新生小鼠心肌再生能力丢失。     

游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质．为研究真核生物的核糖体蛋白L11的功能,从八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）大核基因组中克隆到核糖体蛋白L11基因,构建了重组表达质粒pGEX-6p1-L11,通过谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析,纯化了重组融合蛋白GST-L11．Pull down 分析显示,八肋游仆虫的核糖体蛋白L11与第一类肽链释放因子eRF1a可以在体外相互作用．这一结果提示,与原核生物一样,低等真核生物的核糖体蛋白L11在肽链终止过程中可能起一定的作用．     

端粒、端粒酶在动脉粥样硬化中的研究进展

端粒是真核生物线性染色体末端的DNA重复序列,维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性。DNA复制过程中,端粒逐渐缩短达到临界值时,染色体DNA被破坏而发生复制型衰老。端粒酶是催化端粒合成的酶,但在正常体细胞中活性很低。动脉粥样硬化是一种衰老相关性疾病,为冠心病、脑梗死、外周血管病发生发展的病理基础。新近研究发现,在动脉粥样硬化患者体内存在较短的端粒,并且较短的端粒更容易导致动脉粥样硬化。本文主要综述了参与动脉粥样硬化形成过程中细胞端粒长度和端粒酶活性的变化,以及这些变化对动脉粥样硬化形成的影响,并概括了动脉粥样硬化的危险因素与端粒和端粒酶的关系。     

八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的

以八肋游仆虫第二类肽链释放因子eRF3基因为模板,用PCR的方法获得eRF3的C端(eRF3C)和C端缺失76个氨基酸的突变体eRF3Ct片段,并构建重组表达质粒pGEX-6p-1-eRF3C和pGEX-6p-1-eRF3Ct,转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达。通过Glutathione Sepharose 4B柱亲和层析纯化,重组蛋白GST-eRF3C和GST-eRF3Ct获得纯化。Western blotting分析表明获得的蛋白为目的蛋白。PreScission酶切割后得到eRF3C和eRF3Ct蛋白。体外pull down分析显示eRF3C和eRF3Ct均能与八肋游仆虫第一类释放因子eRF1a相互作用,这表明八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的。     

CRISPR/Cas9与心血管疾病

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins)作为一种新型基因组编辑技术,为解释疾病的发生机制和治疗疾病提供了新方法。来自Ⅱ型原核CRISPR系统的CRISPR/Cas9能够通过单链向导RNA(single guide RNA, sgRNA)将Cas9核酸酶靶定到特定的基因组序列发挥作用。已经被成功用来进行基因编辑构建疾病模型,以进行相关领域的功能研究和疾病的治疗。CRISPR/Cas9技术正在迅速的应用于生物医学研究的各个领域,包括心血管领域,它促进了人们对电生理、心肌病、心律失常以及其他心血管疾病的更多了解,已经创建了靶向很多基因的细胞和动物模型,为新一类疗法打开了大门。本综述介绍了CRISPR/Cas9的作用原理、优点和局限性,以及在心血管疾病中的应用进展。     

核糖体蛋白L11及其功能

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质,是蛋白质合成过程中所必需的.L11由N-末端和C-末端两个结构域组成.L11的N-末端在蛋白质合成中作为分子开关,在多肽链的延伸阶段与延伸因子EF-G相互作用,对EF-G依赖的迁移过程是必需的;在肽链终止阶段与肽链释放因子RF1相互作用,对RF1识别终止密码子UAG的功能是必需的.L11上有一个与噻唑类(thiazole)抗生素结合的靶位点,这种结合会抑制依赖延伸因子的核糖体的活性.