抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

引入CpG基序的汉滩病毒G2糖蛋白基因的克隆及表达

构建汉滩病毒G2糖蛋白的真核表达载体,并加入可增强小鼠免疫刺激作用的CpG基序,检测其可否在真核细胞中表达。参照Genebank中汉滩病毒M的全基因序列设计引物,引物两端引入可增强小鼠免疫刺激作用的CpG基序及双酶切位点,通过聚合酶链反应(PCR)获得含CpG基序的G2片段,并将其与T载体pMD18-T相连,测序后克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,将此真核表达载体以脂质体法转染至真核细胞Vero-E6中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现转染后的Vero-E6中出现特异性的绿色荧光。结果表明本实验成功构建了汉滩病毒包膜糖蛋白G2的重组体。     

增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用

以往的研究表明非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构是一种很有希望的候选疫苗佐剂。为了研究增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用,在本实验中,将重组真核表达质粒 pcDNA3.1 S(ISS)直接肌注免疫BALB/c 小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测 T细胞增殖反应,以及用ELISA kit检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL 4和IFN γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。结果显示 pcDNA3.1 S(ISS)接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IFN γ的产生水平较对照组 pcDNA3.1 S和空载体 pcDNA3.1 接种组的要高。而细胞因子 IL 4 较对照组却无明显变化。由此可见,增加CpG基元的质粒能够增强其所诱导的免疫反应,可用于那些需要借助强有力细胞免疫来清除病原体的疫苗研制中。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

肾综合征出血热(HFRS)是一类由汉坦病毒引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性病毒性传染病.     

人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7噬菌体抗体库的构建

构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。     

人免疫球蛋白重链可变区基因引物设计方法的改良

针对抗体胚系基因数据库的数据不断更新和完善,为获得人全部免疫球蛋白(Ig)重链可变区基因,改进引物设计方法,自主设计针对可变区基因高度保守的框架区1(FR1)和框架区4(FR4)的引物,提取未经免疫的健康人外周血单个核细胞,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列分析符合人免疫球蛋白重链基本框架结构,为胚系基因重排产生的序列.多个克隆的测序结果对比分析显示了良好的多样性.获得的重链序列为研制基因工程抗体及构建噬菌体抗体库奠定了物质基础,也为扩增其他物种Ig可变区基因的引物提供新的设计思路.     

汉坦病毒核蛋白基因疫苗的初步研究

探讨了汉坦病毒核蛋白(NP)S基因疫苗的免疫效果。构建重组真核表达质粒pcDNA3.1 S,直接肌注免疫BALB/c小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测T细胞增殖反应,以及用ELISAkit检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL-4和IFN-γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。pcDNA3.1 S接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IL-4和IFN-γ的产生水平均较对照组pcDNA3.1 空载体接种组的要高。编码核蛋白的S基因的核酸免疫可同时启动机体的细胞免疫和体液免疫反应,S基因是汉坦病毒核酸疫苗的一个比较理想的侯选抗原基因。     

肾综合征出血热早期诊断方法的比较

应用免疫-PCR方法和ELISA法对比检测96份肾综合征出血热(HFRS)患者血清标本中特异性IgM抗体,结果免疫-PCR方法的阳性检出率高于ELISA法,表明免疫-PCR方法是一种可用于HFRS早期诊断的高敏感性的血清学检测方法。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

To improve the effect of the gene immunization against Hantaan virus, we constructed the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) containing Hantaan Virus S gene coding region and CpG motif by cloning S gene segment with CpG motif into eukaryotic expression vector pTARGET^TM.After conformed by enzyme analysis, the recombinant expression vector pTARGET-hans(ISS) was transferred into Vero-E6 cells by electroporation and the transient expression of Hantaan virus nucleocapsid protein was detected by indirect immunofluorescence assay(IFA). In some transferred Vero-E6, the green fluorescence was showed, thus we can conclude that the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) was successfully constructed and expressed in vitro,which will lay a foundation for further animal vaccination.     

免疫-PCR法检测梅毒螺旋体特异性抗体

以梅毒螺旋体重组蛋白为抗原,应用免疫-PCR方法检测梅毒螺旋体抗体,并同常规ELISA法进行比较,探讨免疫-PCR方法检测梅毒螺旋体特异性抗体的可行性。结果免疫-PCR法敏感性是常规ELISA法的104倍,阳性检出率高于ELISA法;对照血清标本梅毒螺旋体抗体检测为阴性。表明免疫-PCR方法具有较高敏感性和特异性,有一定的临床推广价值,对梅毒患者的早期诊断及时治疗等具有重要意义。