小麦TaMBD2原核表达载体的构建和诱导表达

构建了小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD2的原核表达载体pGEX-TaMBD2,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中优化了融合蛋白GST-TaMBD2的诱导表达条件.结果表明,用0.3、0.5和1.0 mm01.L-1的IPTG诱导后,融合蛋白GST-TaMBD2均能有效表达,以1.0mmol·L-1IPTG诱导的效果最好;从诱导表达的时间来看,3种浓度IPTG诱导1 h后融合蛋白均开始表达,且表达量随着诱导时间的延长而逐渐增加,但在诱导6 h后的表达量增加幅度不大,因此确定诱导融合蛋白GST-TaMBD2表达的最佳IPTG浓度为1.0 mm01.L-1诱导时间为6 h.     

风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

目的:表达风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组融合蛋白.方法:经过双酶切鉴定和测序鉴定的阳,陛重组质粒载体pGEX-2T/E1-N,转化到感受态大肠杆菌BL21后,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,并对诱导条件进行优化.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定.结果:用IPTG可以诱导E1特异肽段的重组融合蛋白表达,37℃诱导时,最佳诱导剂浓度为1 mmol/L,最佳诱导时间为4h.诱导温度从37℃降至16℃时,重组融合蛋白以可溶性形式表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的重组融合蛋白.结论:利用原核表达系统可以获得纯化的风疹病毒E1特异肽段的重组融合蛋白.     

长春花金属硫蛋白基因原核表达载体的构建及表达研究

将从长春花中克隆的金属硫蛋白基因（GenBank登录号：DQ016341）构建到高效原核表达载体pGEX-6P-1,并命名为pGEX-6P-1-CrMT,并对GST-CrMT融合蛋白的表达进行诱导和条件优化。对不同的诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,随诱导时间增长GST-CrMT融合蛋白表达量提高,22℃,24 h和37℃,240 min均能诱导GST-CrMT融合蛋白的最大量表达,在0.8 mmol·L^-1 IPTG浓度下可以有效诱导GST-CrMT融合蛋白的表达。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

蓖麻RcTUBβ1基因的克隆和原核表达

微管蛋白基因(Tubulin)具有高度的保守性,常作为目标基因相对表达量研究时的内参基因.本研究旨在通过构建蓖麻(Ricinus communis L.)RcTUBβ1基因的原核表达载体pET32a(+)-RcTUBβ1并优化表达工艺以表达融合蛋白His-RcTUBβ1.以蓖麻雌花为材料,通过RT-PCR技术,扩增得到含酶切位点BamHⅠ和Xho Ⅰ 的 RcTUBβ1 基因(GenBank Accession number:XM_002509734.3)的ORF 序列,经双酶切构建原核表达载体pET32a(+)-RcTUBβ1,将pET32a(+)-RRcTUBβ1转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,并考察诱导时间、诱导温度、诱导IPTG浓度对表达的影响.结果表明,所获得的蓖麻RcTTUBβ1 ORF序列与GenBank中的序列一致,长度为1 341 bp,未发生移码突变.IPTG可诱导产生分子量约为68kDa的融合蛋白,最优表达条件为诱导温度28℃、诱导时间7 h和IPTG 0.5 mmol/L,融合蛋白主要以包涵体的形式存在.这为纯化融合蛋白以制备其抗体,用以研究RcTUBβ1的免疫组织化学分布及时空表达模式提供了基础.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

抗肿瘤肽QX3-1融合蛋白在大肠埃希菌中表达条件的优化

优化抗肿瘤肽QX3-1融合蛋白在大肠埃希菌中的表达条件,提高表达量。从培养基、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间4个单因素实验入手,优化QX3-1融合蛋白的表达条件,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和Band Scan凝胶分析软件分析QX3-1融合蛋白的表达量。p ED-QX 3-1/BL21重组菌在LB、大豆肉汤、TB和酪蛋白胨(自制) 4种培养基中,于酪蛋白胨培养基中的表达量最高;在20、25和37℃三种诱导温度下,于37℃环境中表达量最高;在1、5、10、15和20 mmol/L乳糖浓度的诱导下,于10 mmol/L乳糖诱导最佳;在30 h的诱导时间内,于第24小时,融合蛋白的表达量最高。从培养基、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间4个变量中筛选出适合QX3-1融合蛋白表达的最佳组合,使融合蛋白的表达量达到了31. 2%,相比未优化前提高了近一倍。     

病原诱导的小麦ERF转录因子TaERF1b的原核表达及纯化

为了得到纯化的TaERFlb活性蛋白,将TaERFlb基因含有AP2／ERF结构域的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中,构建GST-TaERFlb融合蛋白表达载体,并转化到犬肠杆菌BL21（DE3）中。0．1mmol／L1PTG即能诱导融合蛋白表达,37℃诱导4h或30℃诱导8h,融合蛋白均以包涵体的形式表达,16℃诱导12h,融合蛋白不表达。包涵体经溶解及稀释复性后,过GST亲和层析柱,获得纯化的融合蛋白,考马斯亮蓝法测得纯化蛋白的浓度约为0．5ug／ul,凝胶阻滞实验表明包涵体复性成功．所得蛋白具有生物活性：     

p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构.方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中.经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构.结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达.透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体.结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体.     

薇甘菊几丁质酶基因的原核表达及活性分析

将薇甘菊Mmchi1基因cDNA序列的编码区插入到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,并在大肠杆菌中进行了融合蛋白6×His-Mmchi1的诱导表达、Western blot和酶活性分析.结果表明,0.1 mmol/L IPTG、25℃诱导4 h,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中能获得可溶性的6×His-Mmchi1;Western blot证实表达的6×His-Mmchi1能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为55 kD,与预测的融合蛋白分子量相符;纯化后的6×His-Mmchi1最佳酶活性pH和温度分别为5.5～6.5和35～40℃.为进一步研究融合蛋白6×His-Mmchi1的功能奠定了基础.