溶菌酶及其分子改造研究进展

溶菌酶是一种优异的天然抗菌蛋白,可以成为抗生素和化学防腐剂的有效替代物,解决日益严峻的细菌耐药性问题和抗生素残留、化学防腐剂超标等食品安全问题。因此,深入研究并构建具有新型广谱杀菌能力的溶菌酶,对食品、医药、畜牧等行业的发展有着重要意义。对溶菌酶的分类、胞壁质酶活性和非酶活性杀菌性质以及蛋白质改造方法,特别是利用现代生物技术对溶菌酶进行抗菌活性增强、抗菌谱拓展的研究进行了综述和展望。     

仙台病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白。方法根据GenBank上发表的仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白基因序列,设计并合成一对引物,通过RT-PCR扩增出核衣壳蛋白全长cDNA序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS,于37℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达,大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约60×103处出现一新蛋白带,与预期目的蛋白分子量相符。结果Western blot检测表明,表达产物能与兔抗SV阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,表明其具有免疫原性。结论为建立以重组NP蛋白为诊断抗原检测SV奠定基础。     

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒（RHDV）VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用

目的建立检测兔病毒性出血症(RHD)血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒,进行初步应用。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原,优化反应条件和筛选试剂,建立间接ELISA检测方法,组装试剂盒并对其总体性能进行评价。结果试剂盒敏感性为血凝抑制试验的4~32倍,重复性和特异性良好,保质期为4℃3个月。对105份兔血清进行随机检测,与血凝抑制试验的复核率为95%。结论本试剂盒可以在检测和科研中初步应用。     

SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8的原核表达

以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29~31kb。基因组从5'到3'端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1]。编码复制酶蛋白的基因,从基因组5'端起约占全长的2/3区域(≈21.2kb),在该区域的nt13392-13398存在保守的UUUAAAC位点,此位点含有-1位的核糖体翻译移框(frameshift),可引发自单一起始位点的蛋白翻译扩展,即由ORF1a编码的Pp1a(约486kDa)扩展为由ORF1b编…     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29～31kb.基因组从5′到3′端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1].     

综述人工合成型抗菌肽及其药学应用研究进展

天然抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）是一类小分子阳离子多肽,具备多种杀菌机制,呈现出高效、广谱的杀菌特性,在抑制耐药性细菌、制备新型抗菌素等方面具有重要的研究价值。以天然抗菌肽为蓝本,设计和开发的人工合成型抗菌肽可以有效克服天然抗菌肽对蛋白酶敏感、细胞毒性较大、生产成本高等缺陷,作为抗感染的潜在药物具有更广阔的应用前景。综述了目前主要的抗菌肽人工改造技术,包括化学修饰法、蛋白质工程技术、计算机分子模拟技术和从头设计最小化抗菌肽方法的研究进展,并对人工合成抗菌肽作为抗菌药物的应用现状进行了简介。     

仙台病毒黑龙江省地方株的分离与鉴定

目的自本省普通级实验动物中分离并鉴定出仙台病毒地方毒株,为建立仙台病毒血清抗体检测方法奠定基础。方法通过鸡胚尿囊腔传代自普通级小鼠肺脏分离病毒,经血凝实验、血凝阻断实验和结构基因序列测定对分离得到的病毒进行鉴定;大量繁殖病毒并通过蔗糖密度梯度离心纯化,免疫动物制备阳性血清,用标准试剂盒检测阳性血清效价。结果自150份小鼠肺脏分离到2株有血凝性的病毒,经形态学、血清学和结构基因序列测定鉴定为仙台病毒,命名为SV-HLJ。SV-HLJ与标准毒株Fushimi核蛋白基因(N)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99·6%和99·0%。结论分离并鉴定出了仙台病毒黑龙江省地方毒株,为检测试剂盒的研制奠定了基础。