结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的:克隆结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,经序列测定正确后进行融合表达和纯化。方法:采用PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009结构域基因,用限制性内切酶消化后插入pUC-19克隆载体中,经测序正确后亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了N端带6个连续组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果:获得了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,得到融合6个组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,纯化获得的蛋白纯度大于87%。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为后续深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1168c蛋白的基因表达、纯化及结构分析

【目的】应用原核表达体系对结核分枝杆菌PPE蛋白家族Rv1168c进行高效表达,进一步进行蛋白纯化和结构分析。【方法】以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增Rv1168c基因,构建pET32a-Rv1168c重组质粒;转化重组质粒到大肠杆菌DH5α并在BL21(DE3)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)鉴定Rv1168c在大肠杆菌中的表达情况;Ni-NTAHis﹡Bind Resin纯化重组蛋白Rv1168c;SDS-PAGE和质谱分析测定相对分子量后,用圆二色光谱(CD)和同源模建方法分析和检测重组蛋白Rv1168c的二级和三级结构。【结果】成功克隆了971bp的目的基因Rv1168c,并获得了高纯度的重组蛋白Rv1168c。重组蛋白的分子量为51.5kDa(含载体蛋白)。25℃时重组蛋白Rv1168c的二级结构包括34.4%α螺旋,33.7%β转角,31.9%无规则卷曲,它的三维模型显示为(β/α)5结构。【结论】成功得到高纯度的重组目的Rv1168c蛋白,并初步进行了结构分析,为进一步对Rv1168c结构和功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果:成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论:成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT-6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

鸟分枝杆菌PhoR基因的克隆及诱导表达

目的:克隆鸟分枝杆菌的PhoR基因,构建高表达重组质粒pGEX-PhoR,确定目的蛋白表达形式,为后续对鸟分枝杆菌PhoR的功能研究打下基础。方法:以一株鸟分枝杆菌临床分离株作为DNA模板,PCR扩增PhoR基因,pGEX-4T-3为载体构建表达质粒,转化到E.coliBL21(DE3)中诱导表达。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式及表达量。结果:扩增出鸟分枝杆菌PhoR基因,构建了重组表达质粒pGEX-PhoR,在BL21(DE3)中以可溶性方式高效表达,经诱导产生与预期值相符的一个约81KDa的融合蛋白。结论:成功构建了pGEX-PhoR重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,为后续深入研究鸟分枝杆菌PhoR的生物活性和免疫活性奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化

Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的生物学功能奠定基础。前期实验发现构建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表达载体均无法实现目的蛋白的诱导表达。但经密码子优化后,仅有pMAL-c2X-Rv2742载体能够实现目的蛋白的可溶性诱导表达。此外,通过比较不同宿主菌、温度及IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响,发现目的蛋白在Rosetta (DE3)中,16℃及0.5mmol/LIPTG诱导条件下表达量最高。直链淀粉树脂(Amyloseresin)亲和层析柱纯化获得较纯的产物,经LC-MS/MS验证确认是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功获得结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742的重组蛋白,可进一步开展其潜在相互作用及免疫原性研究工作。     

复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用

目的:在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A(resuscitation-promoting factor-interacting protein A,RipA),观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用.方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA.以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG)诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化.将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,分光光度法测定细菌的A600,观察RipA蛋白的促生长作用.结果:成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆.经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子量为52kDa的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6x His单抗有特异性的反应条带.采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白.10%M的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长.结论:Papa蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长.     

针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）,并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）;PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）;PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠,共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞,外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加,CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

The life and death of gene families

One of the unique insights provided by the growing number of fully sequenced genomes is the pervasiveness of gene duplication and gene loss. Indeed, several metrics now suggest that rates of gene birth and death per gene are only 10–40% lower than nucleotide substitutions per site, and that per nucleotide, the consequent lineage‐specific expansion and contraction of gene families may play at least as large a role in adaptation as changes in orthologous sequences. While gene family evolution is pervasive, it may be especially important in our own evolution since it appears that the “revolving door” of gene duplication and loss has undergone multiple accelerations in the lineage leading to humans. In this paper, we review current understanding of gene family evolution including: methods for inferring copy number change, evidence for adaptive expansion and adaptive contraction of gene families, the origins of new families and deaths of previously established ones, and finally we conclude with a perspective on challenges and promising directions for future research.     

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠PCR技术（又称重叠区扩增基因拼接法）对hGM-CSF基因内第28位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因,腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子－基因三者之间的拼接,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变,其成功率为100％,这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理,技术操作员简单易行,在基因拼接,基因内部突变方面具有良好的应用价值。     

成簇基因的时空表达调控

成簇基因具有不同单个基因的特性,同一簇内基因大多有类似的结构,功能以及表达模式,基因之间时空表达模式及表达量高度协调,提示同一簇基因是作为统一整体进行调节的,具有共同的调节机制。基因成簇排列是实现基因时空协调表表达的基础,是遗传信息的一种高级组织形式,具有强大的进化优势,要揭示成簇基因表达调控的基本规律,应从顺式作用元件,反式作用因子,染色质等层次,进行整体的以及多基因相互作用的研究,这些机制的阐     

基因功能研究方法浅介

随着人类基因组计划的进展,数据库中积累了越来越多未知功能的基因序列,分析这些基因的功能将成为基因组计划的主要任务。本介绍了几种研究特定基因功能的方法及程序。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

非病毒基因治疗的研究进展

非病毒基因治疗是相对于病毒性基因治疗而言,指采用非病毒的载体进行的基因治疗。非病毒的基因载体比病毒性基因载体具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特点。本文就非病毒基因治疗所采用的主要方法、面蜂的主要问题及发展方向作一概括的介绍。随着人类对疾病发病分子机制的深入研究及人类基因组计划的实施,非病毒基因治疗将在人类疾病的治疗中发挥重要作用。     

BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因,建立BPOZ基因剔除小鼠模型,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列,设计基因剔除策略,构建完成了基因剔除载体XpPNT-BPOZ.以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得抵抗克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆.将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只,其中15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠,阳性率为50%.在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠.初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常,有繁殖能力,进一步的表型分析工作正在进行之中.     

杆状病毒凋亡抑制基因的研究进展

杆状病毒(bacu lovirus)感染昆虫细胞能引起细胞凋亡,但在长期进化过程中,杆状病毒可通过自身编码凋亡抑制基因的表达,抑制细胞凋亡以利于自己的增殖。目前在杆状病毒基因组中已发现两种不同类型的细胞凋亡抑制基因p35/p49和iap,这两类凋亡抑制基因分别作用于细胞凋亡途径的不同位点,以抑制细胞的凋亡。近年来人们对这两种基因的蛋白结构及作用机制等方面进行了大量的研究,这些为今后研究昆虫细胞凋亡,扩大杆状病毒宿主范围等方面奠定了基础。     

性别决定基因SRY的研究进展

SRY基因是哺乳动物性别决定过程中的主宰基因,其表达产物SRY蛋白是一种DNA结合蛋白,该蛋白含有一个HMG盒,能够以序列特异性结合到DNA双螺旋链的一侧,起到转录因子的作用。调节或协同下游基因如SOX9、AMH等基因的表达,使胚胎发育向雄性方向发展。