低氧对体外培养鸡原始生殖细胞凋亡的影响

本研究的目的是通过低氧处理体外培养的鸡原始生殖细胞(Primordial germ cell)优化培养系统,降低细胞凋亡率,提高细胞活力,为高效生产转基因鸡提供科学依据。研究采用低氧气体(1%O_2)分别处理鸡PGCs 6 h、12 h、24 h,随后用q-PCR检测凋亡相关基因Caspase3的表达。与常氧组(21%O_2)相比,1%O_2-24h低氧组Caspase3显著下调(p0.05)。进一步检测1%O_2-24 h低氧组p53和Bcl2的表达情况,结果显示p53表达显著下调(p0.05),Bcl2表达无显著差异。采用流式细胞术检测细胞凋亡比例,低氧组((13.5±0.8)%)凋亡比例低于常氧组((21.8±2.1)%)。采用q-PCR,免疫荧光染色,细胞迁移鉴定低氧处理后的鸡PGCs生物学特性,发现其仍保持生殖细胞的生物学特性。本研究表明,在体外培养条件下,1%O_2低氧处理鸡PGCs 24 h能抑制细胞凋亡,且不改变其生物学特性。     

藏羚羊成纤维细胞系的建立及其核型分析

藏羚羊(Pantholops hodgsonii)是我国特有的国家Ⅰ级重点保护野生动物,生存在高海拔低氧环境下,具有高原生物的细胞遗传特性。实验采用组织块贴壁培养法进行原代培养,后经差异贴壁法联合消化排除法纯化,成功构建了藏羚羊成纤维细胞系,并对培养不同代次细胞的形态、生长动力学、染色体核型等进行了研究。结果表明,培养得到的藏羚羊细胞为典型的成纤维细胞,第7、10、15代细胞群体倍增时间分别为26、48、50 h。细胞的生长均为"S"型。染色体中二倍体染色体(2n=60)占主体,所占比例为65%～91%,包括性染色体X、Y在内均为端着丝粒类型,染色体组的总相对长度为193.45,平均相对长度为3.22,未发现随体、次缢痕等特殊标志性特征。     

雷帕霉素对低氧下人HL-60细胞增殖和凋亡的影响

本研究拟通过小分子化合物氯化钴（CoCl2）模拟的低氧环境,探讨雷帕霉素（RPM）对该低氧下人急性髓细胞白血病HL-60细胞的生物学行为的影响。低氧模拟组、低氧雷帕霉素处理组、常氧雷帕霉素处理组HL-60细胞分别采用CoCl2、CoCl2／RPM、RPM进行处理,对照组为常氧下常规培养的HL-60细胞,处理及培养24h、48h、72h后收集细胞,采用倒置相差显微镜观察细胞生长状况,常规瑞氏染色后光学显微镜下观察细胞形态;MTT比色法检测各组细胞的活性和增殖能力;AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,与对照组细胞形态规则,胞核呈圆形或椭圆形相比,低氧模拟组和低氧雷帕霉素处理组细胞密度降低,生长明显受抑,细胞胞核呈不规则形或杆状,染色质粗糙,伴扭曲折叠等变化。各组间不同时问细胞增殖抑制率差异显著（P〈0．05）,低氧模拟组和低氧雷帕霉素处理组增殖抑制率随着处理时间延长而增大,且低氧雷帕霉素处理组的增殖抑制率大于低氧模拟组。与常氧下的对照组及雷帕霉素处理组比较,低氧的模拟组和雷帕霉素处理组诱导细胞发生较明显的凋亡,且后期72h低氧雷帕霉素处理组凋亡率显著高于模拟低氧处理组。以上结果表明,模拟低氧环境下,HL-60细胞生长明显受抑制,且诱导细胞凋亡;雷帕霉素可增强对低氧对细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。     

绵羊粒细胞集落刺激因子原核表达与提纯及用于颗粒细胞培养的效果

文中旨在研究粒细胞集落刺激因子(Granule cell stimulating factor,GCSF)对绵羊颗粒细胞体外培养过程中细胞增殖和凋亡的影响,明确GCSF对绵羊颗粒细胞生存的调节作用,为今后该蛋白用于羊繁育方面的研究奠定基础。原核克隆表达纯化羊GCSF蛋白,纯化的蛋白用M-NSF60细胞检测生物学活性,将纯化的GCSF添加到颗粒细胞培养基中作为试验组,以培养基中未添加GCSF的细胞为对照,利用Alarmarblue检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果表明,羊GCSF可以原核表达并纯化,并且具有生物学活性。在24 h和48 h时,在0.06–600 ng/mL的范围内随着加入GCSF的终浓度增加,细胞活力升高。试验组颗粒细胞体外培养24 h后,与阴性对照相比,细胞周期的分布显著改变,S期细胞比例显著减少(P0.05),G2/M期细胞比例显著增多(P0.05)。试验组凋亡率和对照组相比,48 h检测时凋亡率显著降低(P0.05)。综上表明,GCSF在体外培养的绵羊颗粒细胞中,可调控绵羊颗粒细胞周期,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。     

牛肝脏细胞体外培养和传代细胞的初步鉴定

该文采用灌注胶原酶消化法分离牛肝细胞,通过DMEM培养基(含10%胎牛血清)体外连续进行原代和传代培养,观察细胞增殖变化及细胞培养过程中的形态消涨变化情况。该文还对第12代培养细胞的染色体情况及细胞生长情况进行分析,同时采用PAS染色法进行糖原含量鉴定。结果显示,分离的肝细胞群体倍增时间为62.8 h,染色体为60条, PAS染色观察发现,培养细胞质中有大量糖原颗粒。     

PPARγ激动剂罗格列酮诱导人前列腺癌细胞系LNCAP凋亡的作用

目的:探讨罗格列酮(ROZ)对体外培养细胞系LNCAP增殖及凋亡的作用.方法:20、50、100 μmol/LROZ作用LNCAP细胞24 h、48 h、72 h后,MTT法检测ROZ对LNCAP细胞生长的影响.采用末端脱氧核苷酸转移酶原位标记(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况.Western Blot检测LNCAP细胞中Casepase-3表达水平的变化.结果:ROZ(20μmol/L至100μmol/L)对前列腺癌细胞有显著的增殖抑制作用,以100μmol/L浓度最为明显.ROZ(100μmol/L)作用72h后最高增殖抑制率达78.58%.流式细胞仪检测结果显示,LNCAP细胞凋亡数目随药物浓度的增加呈递增趋势;100μmol/LROZ作用72h后凋亡细胞数达48.11%.与此一致,TUNEL染色阳性细胞数目在ROZ处理组显著增多,Western Blot检测显示,ROZ显著增加LNCAP细胞中Caspase-3蛋白表达水平.结论:ROZ在体外对前列腺癌细胞系LNCAP有明显的增殖抑制及促进凋亡作用,有望成为前列腺癌患者新的治疗方法.     

加味苇茎汤及其成分芹菜素对肺腺癌A549细胞增殖、周期与凋亡的影响

探讨加味苇茎汤含药血清及成分芹菜素对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,选用肺癌A549细胞体外培养,在不同浓度含药血清及芹菜素作用下,用MTT法检测细胞生长抑制率、流式细胞术检测细胞周期及凋亡率、hoechst33342染色检测细胞凋亡形态。结果显示,加味苇茎汤含药血清及芹菜素对A549的生长抑制率:24 h分别为31%、34%,48 h分别为45%、53%;流式细胞术检测细胞周期发现A549细胞经加味苇茎汤含药血清处理后主要阻滞在G2期,而芹菜素能明显引起细胞凋亡。荧光显微镜下观察到较典型的细胞凋亡形态甚至细胞脱落,视野内细胞核数明显减少。该研究结果显示,加味苇茎汤含药血清及芹菜素能明显抑制A549细胞的增殖,引起细胞周期阻滞、诱导其凋亡。     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

中华鼢鼠成纤维细胞长期培养及其生物学特性分析

中华鼢鼠(Eospalax fontanierii)为蒙古高原代表性动物遗传资源,本研究采集中华鼢鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉、气管、剑状软骨和尾尖皮肤共9种组织用于实验,其中气管、肺和剑状软骨3种组织成功建立成纤维细胞系,传了8代,并分析了这些细胞的生物学特性。主要实验方法是通过细胞计数法计算细胞的贴壁率、冻存前及复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线;制备常规染色体标本分析染色体核型。实验结果显示,中华鼢鼠气管、肺、软骨3种组织在体外条件下培养,第3～4天出现成纤维样细胞,原代细胞分别在培养第11天、第16天、第17天,达到90%以上汇合。3种组织来源体细胞均显示成纤维细胞特征,气管成纤维细胞贴壁能力最强,24 h贴壁率最高能达到98.10%,肺成纤维细胞与剑状软骨成纤维细胞贴壁能力较弱,24 h贴壁率最高,分别为95.28%和94.88%。3种来源成纤维细胞生长曲线测定结果显示,气管成纤维细胞的增殖能力最强、肺成纤维细胞次之、剑状软骨成纤维细胞最弱。气管成纤维细胞和肺成纤维细胞在接种后的第6～7天,进入对数生长期。剑状软骨成纤维细胞在接种后第2～3天进入对数生长期。3种成纤维细胞的生长曲线均呈"S"型,其中气管成纤维细胞增殖能力最强,在24孔板的每个孔中,其最大增殖数目为2.435×10~4个,肺成纤维细胞最大增殖数目为1.813×10~4个,剑状软骨成纤维细胞最大增殖数目为1.521×10~4个。核型分析结果显示,中华鼢鼠的成纤维细胞染色体数目为2n=62,30对为常染色体,1对为性染色体。综上所述,本研究成功建立了中华鼢鼠成纤维细胞体外培养体系,并揭示了该物种成纤维细胞的基本生物学特性,为深入研究中华鼢鼠适应低氧高二氧化碳洞道生境的分子生物学和生理学机制提供了条件,为进一步研究其遗传及物种进化提供了实验材料和参考。     

亚砷酸钠对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒作用分析

该研究将辽宁绒山羊作为一种新的砷染毒动物模型来探究亚砷酸钠对其皮肤成纤维细胞的毒性作用,为砷影响绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性效应及毒理作用机制提供理论依据。实验中采用不同浓度(0～120 μmol/L)的亚砷酸钠对绒山羊皮肤成纤维细胞分别染毒24、48、72、96 h。通过MTT法检测各实验组亚砷酸钠对细胞增殖与抑制的影响;用免疫荧光、透射电镜观察细胞骨架、细胞质与细胞器的变化;用彗星实验检测DNA损伤;用流式细胞仪检测细胞凋亡及溶酶体和线粒体的变化。研究发现在处理时间为24 h和48 h时,剂量范围为0～5 μmol/L的亚砷酸钠能促进绒山羊皮肤成纤维细胞增殖,5～120 μmol/L浓度的亚砷酸钠会引起细胞毒性和基因毒性;72 h和96 h时各浓度亚砷酸钠始终对细胞生长表现出抑制作用。当处理时间为24 h时,亚砷酸钠已经对细胞表现出明显的毒物兴奋效应,因此,该文选取24 h为亚砷酸钠染毒辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的最佳处理时间。低水平(0～5 μmol/L)亚砷酸钠处理细胞时,此时细胞骨架形态均匀且细胞骨架中微管蛋白聚合,活细胞数目增多,细胞器完整,线粒体膜电位升高,溶酶体数量增多;高水平(5～120 μmol/L)亚砷酸钠处理细胞时,细胞骨架形态差异较大,微管蛋白荧光明显减弱,细胞器损伤、DNA损伤严重、细胞凋亡数目明显增多,溶酶体活性和线粒体膜电位(ΔΨm)降低,表明亚砷酸钠诱导的绒山羊皮肤成纤维细胞凋亡机制可能与溶酶体和线粒体途径相关。该研究得出亚砷酸钠对绒山羊皮肤细胞的毒性作用呈"剂量–时间效应"关系,即作用时间为24 h时,低浓度的亚砷酸钠会促进细胞增殖,且对细胞生长起促进作用的最佳浓度为0.5 μmol/L,然而亚砷酸钠(5 μmol/L)会引起绒山羊皮肤成纤维细胞的细胞毒性与基因毒性。     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞pHi及细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨低氧肺血管结构重建时是否伴有PASMCs凋亡.方法: 体外低氧培养大鼠PASMCs,BCECF法测定细胞内pH值、光镜及电镜观察细胞形态、流式细胞仪测细胞周期、原位细胞凋亡(TUNEL法)观察细胞凋亡.结果: PASMCs在低氧早期即出现细胞内碱化,低氧6 h即出现G0/G1期细胞比例减少,G2/M期细胞比例增加,至24 h丝裂活动最强,但细胞凋亡率无显著变化.结论: 低氧PASMCs在细胞内碱化、细胞增殖的过程中不伴有细胞凋亡的改变.     

应用引物原位标记技术检测21号染色体

应用原位引物标记技术（PRINS）检测了21号染色体着丝粒,在外周血和绒毛细胞的标记效率分别为91％和93％,实验过程可以在2h之内完成,证明这一检测方法是一种快速、灵敏、特异性良好的染色体数目检测方法,有可能用于21号染色体数目异常的快速诊断。     

人类脂肪来源成体干细胞体外培养的生物学特征研究及供体年龄对其增殖的影响

通过研究人类脂肪组织来源成体干细胞(human adipose tissue derived adult stem cells, hADAS细胞)体外培养的生物学特征及供体年龄对其生长增殖的影响, 为其作为组织工程学研究和应用的种子细胞提供实验室研究基础. 取不同年龄组志愿者(<20岁、21~40岁、41~60岁和>61岁), 手术中切除少量皮下脂肪组织, 酶消化法分离细胞, 体外培养, 传至20代. 取培养第3代细胞, 流式细胞仪检测细胞表面抗原标记物(CD29, CD34, CD44, CD45, CD49d, HLA-DR, CD106)和细胞周期. 细胞培养传20代后进行细胞染色体组分析. MTT法分别检测各年龄组不同时间点吸光值, 绘制生长曲线, 根据公式换算人类脂肪来源干细胞倍增时间(time doubling, TD). 结果显示: 酶消化法自皮下脂肪组织分离细胞, 体外培养hADAS细胞, 流式细胞仪检测示CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD49d±, HLA-DR-, CD106-; G1期占90%(P10代); P20细胞染色体组分析显示为正常染色体, 未见异常染色体, 保持遗传稳定. 绘制细胞生长曲线, <20年龄组TD为(11.22±0.73)h, 21~40年龄组TD为(11.14±0.76)h, 两组之间P >0.05, 无显著性差异; 41~60年龄组TD为(13.18±1.58)h , >61年龄组TD为(13.11±0.83)h, 两组之间P>0.05, 无显著性差异. <20年龄组TD与>61年龄组TD显著性差异, P<0.05. 说明hADAS细胞可方便地取材于皮下脂肪组织, 体外培养遗传特性稳定, 生长活跃, 青年组生长活性强于老年组, 可以作为组织工程学种子细胞的新来源.     

Beagle犬血清与胎牛血清生化特性及其对体外培养的人肺癌细胞生长的影响

目的比较Beagle犬血清与胎牛血清生化特性,探讨它们对体外培养的人肺癌细胞生长的影响。方法收集、制备Beagle犬血清与胎牛血清,采用全自动血液生化分析仪测定23项血清生化指标,比较分析两组血清生化特征差异。取对数期人肺癌细胞QG-56,分别培养于含10%FBS或Beagle-S的RPMI-1640合成培养基中,于第0、24、48、72、96、120和144 h各取出一块培养板进行检测,观察不同血清对细胞生长MTT曲线、细胞形态学的影响。结果FBS中CK、CK-MB、LDH、HBDH、GGT水平明显高于Beagle-S（P〈0.05）;CHE水平却明显低于Beagle-S,两者之间比较,均具有显著统计学意义。血清中的BUN、CRE、GLU、TP、ALB、ALT、ALP、TBIL、DBIL、TG、K^＋、Na^＋、Cl^-、Ca^2＋、Pi^3-水平在Beagle犬与胎牛间无显著性差异。MTT曲线和细胞形态学观察,两组于干预后24、48、72、96、120、144 h对QG-56细胞株生长的影响无显著性差异（P〈0.05）。结论Beagle犬的血清生化特性及其对体外肺癌细胞生长的影响与胎牛相似,可作为血清药理研究的优选动物之一。     

模拟高原低氧对小鼠红细胞介电特性的影响

目的：探讨模拟高原低氧对小鼠红细胞介电特性的影响。方法：实验动物分成平原对照组和模拟高原低氧组,采用Agilent 4294A阻抗分析仪测量小鼠红细胞交流阻抗,通过细胞介电谱、Cole-Cole图、介电损耗因子频谱、损耗角正切频谱以及Cole-Cole方程的曲线拟合分析,观察模拟高原低氧对红细胞介电特性影响。结果：小鼠模拟海拔5000 m低氧4周后,模拟高原组的低频介电常数εl和介电增量Δε较平原对照组分别增加57%和59%;模拟高原组的低频电导率κl和高频电导率κh较平原对照组分别降低49%和11%。结论：模拟高原低氧可以引起小鼠红细胞介电性增加和导电性降低。     

牛脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定

为了给组织工程提供种子细胞,对牛间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)进行体外分离培养。首先应用胶原酶消化法分离牛ADSCs,进行体外培养、连续传代,并观察细胞的形态变化,通过细胞计数绘制生长曲线,细胞压片进行染色体分析,采用细胞免疫荧光化学方法检测细胞表面标记,利用成骨分化和成脂分化检测其分化能力。结果显示牛ADSCs体外培养时细胞形态呈成纤维细胞样,增殖稳定;Vimentin、CD49d、CD13表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性高,茜素红染色呈阳性;成脂诱导条件下细胞周围脂滴明显,油红-O染色呈阳性。结果证明牛ADSCs体外生长稳定、增殖速度快、定向分化能力强,简易的体外分离培养及诱导方法为其在组织工程中的应用奠定了基础。     

藏红花素对C6胶质瘤细胞生长及Survivin和Livin表达的影响

目的:研究藏红花素对大鼠C6胶质瘤细胞生长及凋亡蛋白抑制因子Survivin和Livin表达的影响。方法:体外培养C6胶质瘤细胞,加入不同浓度的藏红花素培养液,并于不同时间点进行观测,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,观察C6细胞的生长活性;通过相差显微镜和Hoechst荧光染色法观察C6细胞的形态学变化;采用Western blot法检测Survivin和Livin蛋白的表达水平。结果:C6胶质瘤细胞经藏红花素作用后细胞生长受到明显抑制,用含2、4和8 mg/ml藏红花素的培养液作用48h后各组C6细胞的OD值分别为0.732±0.013、0.421±0.010和0.289±0.017,细胞生长抑制率分别为26.8±0.01%、58.0±0.02%和71.1±0.02%,其中4 mg/ml和8 mg/ml藏红花素实验组细胞生长抑制率与阴性对照组均有显著性差异(P均0.05);相差显微镜和Hoechst荧光染色法观察显示实验组C6细胞出现典型的凋亡形态学改变;Western blot检测显示实验组C6细胞Survivin和Livin蛋白表达明显下调。结论:藏红花素能明显抑制C6胶质瘤细胞的体外生长,其抑制作用与诱导C6细胞发生凋亡和下调凋亡蛋白抑制因子Survivin和Livin的表达有关。     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

低氧对血清剥夺后山羊颞下颌关节盘细胞凋亡和自噬的影响

该研究体外分离山羊颞下颌关节盘(temporomandibular joint disc,TMJ disc)细胞并培养至p2代。通过HE(Hematoxylin-Eosin)染色、Hoechst 33258和丹磺酰戊二胺(dansylcadaverine,MDC)荧光染色观察血清剥夺后细胞的形态学变化以及是否存在自噬和凋亡。随后,通过流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)分别检测血清剥夺0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h后细胞的凋亡率和自噬水平的变化以及加入自噬抑制剂3-MA(3-methyladenine)后的凋亡变化。检测给予血清(10%FBS)或血清剥夺(0%FBS)的细胞在常氧(21%O2)或低氧(2%O2)条件下的凋亡和自噬的变化。结果发现:血清剥夺后,凋亡率随时间的延长逐渐上升,自噬率先上升后下降;当血清剥夺诱导的自噬被3-MA抑制后,细胞的凋亡率明显上升。自噬能够抑制血清剥夺引起的细胞凋亡,说明自噬在细胞的存活中有很重要的作用。与常氧培养的细胞相比,低氧条件下细胞的凋亡率和自噬率均下降。低氧通过降低细胞的过度自噬减少长期血清剥夺引起的细胞凋亡,比常氧更有利于细胞的存活。     

低氧预适应对离体星形胶质细胞低氧耐受性的影响

目的：研究低氧预适应对体外培养的星形胶质细胞低氧耐受性的影响。方法：体外培养的鼠脑星形胶质细胞,随机分为对照组（control,C组）,低氧损伤组（hypoxia,H组）,低氧预适应组（hypoxic preconditioning,HP组）,通过检测细胞MTT代谢变化、凋亡发生和形态学观察探讨低氧预适应对星型胶质细胞低氧损伤的保护作用;免疫细胞化学方法分析Bcl-2和Bax的表达差异。结果：与低氧组相比,HP48、HP72组MTT代谢活性较高。免疫细胞化学结果提示低氧预适应组Bcl-2表达高于低氧损伤组,低氧预适应组Bax表达低于低氧损伤组。结论：低氧预适应对大鼠星形胶质细胞低氧损伤有保护作用,可能与Bax表达受抑,维持Bcl-2表达有关,通过对抗凋亡程序的发展产生保护作用。