肺炎链球菌LytR蛋白影响细菌生长和磷壁酸的合成

为了初步明确lytR基因的保守性以及探讨LytR蛋白在肺炎链球菌中的生物学功能。本研究利用PCR和测序方法分析lytR基因20种不同序列型肺炎链球菌临床分离株的保守性;利用Western blotting技术分析lytR在细菌不同生长阶段的表达情况;随后,利用红霉素片段替代lytR基因构建D39ΔlytR缺陷菌株,通过生长曲线分析、电镜下形态观察、以及磷壁酸含量测定揭示LytR蛋白在细菌生长、细菌形态以及磷壁酸合成中的作用。研究发现20种不同序列型肺炎链球菌临床菌株的lytR基因序列一致性99.3%;Western blotting结果显示lytR在细菌不同生长阶段稳定表达;D39ΔlytR缺陷株生长明显变缓,细菌表现为不成熟自溶;D39ΔlytR全菌磷壁酸含量显著减少,而培养基上清中的磷壁酸含量显著增多。本研究表明lytR基因非常保守,在肺炎链球菌不同生长阶段均有表达,并可能通过连接酶的作用影响细菌生长和参与肺炎链球菌磷壁酸的合成,有望成为一种新的抗生素和药物靶点。     

肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对荚膜多糖的调控作用

摘要:【目的】研究肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对肺炎链球菌荚膜多糖(CPS)的调控作用。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌原核表达CcpA蛋白,使用Ni2+亲和层析的方法纯化蛋白。利用纯化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制备多克隆抗体;采用ELISA法测定抗CcpA抗体效价。随后,利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎链球菌中的保守性。另外,利用EMSA方法分析CcpA与cps基因座启动子区域片段的结合。最后,构建ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株;利用ELISA法测定野生D39菌 株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株的荚膜多糖含量。【结果】Western blot结果显示CcpA蛋白在多种血清型的肺炎链球菌均有表达,CcpA蛋白可与cps基因座启动子区域结合,且呈剂量依赖性;ccpA基因缺失时,细菌CPS含量升高,回复表达CcpA蛋白后,CPS含量显著降低。【结论】CcpA是肺炎链球菌中一种保守表达的蛋白,可通过调节cps基因座启动子负性调控肺炎链球菌荚膜多糖的表达。     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

马卵母细胞体外成熟的初步研究

采用抽吸法和切割法两种采卵方法收集马卵母细胞,显示采用切割法的卵母细胞回收率为83%,高于抽吸法的回收率46.5%(P＜0.05),在卵母细胞的成熟上,使用M199和DMEM/F12两种培养液为基础液的成熟体系,紧凑型(Cp)COCs和扩展型(Ex)COCs在以M199为基础液和以DMEM/F12为基础液的培养液中的卵母细胞成熟率分别为41.7%和64.7%、46.7%和66.7%,差异不显著(P＞0.05).两种培养体系中成熟的Cp COCs采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,在以M199和以DMEM/F12为基础液的培养液中成熟的卵母细胞的卵裂率分别为45%和57.1%,差异不明显(P＞0.05).     

一种减毒肺炎链球菌溶血素突变体的构建与表达

目的使用重叠PCR方法构建构建△Al46Ply突变体,原核可溶性表达△Al46Ply蛋白,并明确其毒力变化情况;分析肺炎链球菌溶血素（pneumolysin,Ply）在不同血清型肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae,SPN）中的表达情况。方法以SPND39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体pry基因所需引物;利用重叠PCR方法扩增合成△Al46ply突变体。通过溶血实验分析其溶血活性,利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力,并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况。结果突变体基因测序结果显示,Plyl46位密码子GCT3个碱基被缺失,△Al46ply突变体构建成功,并实现了△Al46Ply的可溶性表达,得到纯度〉90％的重组蛋白。△A146Ply蛋白浓度为100000ng／ml亦未表现出溶血活性。△Al46Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性。Western印迹结果显示,△Al46Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应。结论△Al46Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子,可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体。     

假想的脂蛋白连接酶对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】探索假想脂蛋白连接酶(putative lipoate-protein ligase,LPL)对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)的方法失活lpl基因,通过PCR、测序鉴定缺陷菌株,采用细胞实验比较缺陷菌和野生菌对宿主细胞的粘附能力,并通过动物实验观察lpl基因缺陷后菌株毒力的变化。【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株和缺陷株半数致死时间均为12h,两者比较无统计学差异;缺陷菌在对宿主细胞的粘附能力明显高于野生菌株(P0.01);体外荚膜染色实验表明,野生菌和缺陷菌均有荚膜。【结论】实验结果提示lpl基因对细菌粘附宿主细胞有抑制作用,但不影响其腹腔感染小鼠的能力。     

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体（FuGENE-6）介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。 Optimization of Parameters of Exogene Transfection of Bovine Fetal Fibroblasts in vitro Mediated by Liposome LI Yang,WU Kai-feng,GUO Xu-dong,GUO Ji-tong,BOU Shor-gan The Research Center for Laboratory Animal Science of Inner Mongolia University,The Key Laboratory of Ministry of Education of China for Mammal Reproduction Biology and Biotechnology,Huhhot 010021,China Abstract:pEGFP-C1 eucaryon expression vector was successfully transfected by liposome into bovine fetal fibroblasts.We investigated the effect of parameter such as the dose of DNA and liposome,number of cell transfected and exposure time of the cell to the DNA-liposome complexes.It was indicated that GFP（green fluorescent protein）expression was enhanced as the dose of DNA and liposome increased and on decline as the exposure time was prolonged.The improvement of transfection efficiency depent on the suitable cell number. Key words：liposome; GFP; bovine fetal fibroblasts; transfection