曲古抑菌素A对体外培养牛成纤维细胞组蛋白乙酰化和甲基化的影响

Trichostatin A(TSA)是一种特异的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。研究显示,TSA可以特异地抑制组蛋白去乙酰化酶活性,提高细胞的组蛋白乙酰化水平,激活基因的表达。但是,目前还不是很清楚TSA处理是否对组蛋白甲基化产生影响。本研究以成纤维细胞为研究对象,利用免疫细胞化学技术及激光共聚焦显微镜,探讨了TSA处理体细胞对其组蛋白乙酰化及甲基化修饰的影响。结果显示,随TSA浓度增加,体细胞形态发生明显的改变,细胞变得扁平且核区较大,处理后组蛋白H4K8位点的乙酰化水平随着TSA浓度的增加明显提高。检测组蛋白H3上两个甲基化位点发现,随组蛋白乙酰化水平的增加,H3K4位点的三甲基化（H3K4me3）水平也显著提高。但是,对于H3K9的二甲基化水平（H3K9me2）则没有明显变化。以上结果显示,TSA的处理不仅可以提高体细胞的组蛋白乙酰化水平,同时也增加了与基因表达激活相关组蛋白修饰位点的甲基化水平,但是对于与沉默基因相关的组蛋白修饰位点则没有明显的影响。     

浮毛茛的组织培养与植株再生

1植物名称浮毛茛(Ranunculus natans C.A.Mey.),又称水毛。2材料类别基生茎。3培养条件愈伤组织诱导培养基:(1)MS 6-BA 1mg·L~(-1)(单位下同);(2)MS 6-BA 1 IBA 0.6:(3)MS 6-BA 1 IAA 0.6:(4)MS 6-BA 1 2,4-D 0.6;(5)MS 6-BA 1 NAA 0.6。愈伤组织分化培养基:(6)1/2MS 6-BA 0.2 NAA 0.1;(7)1/2MS 6-     

绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎的制备

利用含有红色荧光和Neor基因双选择标记的IGF1毛囊特异表达载体pCDsR-KI转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得具有红色荧光的IGF1转基因细胞.核移植操作前,通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离,确定20h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间.比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激活效率和孤雌胚早期发育的影响,结果表明：IA23187＋6-DMAP组的激活效率和囊胚率（88.7%＆21.6%）均稍高于乙醇＋6-DMAP组（86.4%＆20.4%）,但二组相应数据之间差异均不显著（P〉0.05）,选择前者作为转基因核移植胚的激活方案;SOFaa和CR1aa两种体外培养体系中,孤雌胚卵裂率（86.8%vs83.9%）和囊胚率（23.1%vs17.2%）均差异不显著（P〉0.05）,选择结果较好的SOFaa组.比较了不同电融合参数的融合效果,结果表明：190V/mm处理组结果（62.4%）显著高于130V/mm（32.8%）和200V/mm（42.9%）组（P〈0.05）.通过T-SCNT获得转基因重构胚胎203枚,48h卵裂率为79.3%（161/203）,第7~9天囊胚发育率为15.3%（31/203）.所得到的31枚囊胚中,较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17枚（阳性率为54.8%）.随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为转基因阳性.以上结果显示：（i）表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因细胞和阳性转基因胚胎;（ii）所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白,说明即使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性,在囊胚期进一步筛选是必要的;（iii）通过TSCNT操作及优化,成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1基因的绒山羊胚胎,为绒山羊的转基因研究提供基础数据.     

藏羚羊成纤维细胞系的建立及其核型分析

藏羚羊(Pantholops hodgsonii)是我国特有的国家Ⅰ级重点保护野生动物,生存在高海拔低氧环境下,具有高原生物的细胞遗传特性。实验采用组织块贴壁培养法进行原代培养,后经差异贴壁法联合消化排除法纯化,成功构建了藏羚羊成纤维细胞系,并对培养不同代次细胞的形态、生长动力学、染色体核型等进行了研究。结果表明,培养得到的藏羚羊细胞为典型的成纤维细胞,第7、10、15代细胞群体倍增时间分别为26、48、50 h。细胞的生长均为"S"型。染色体中二倍体染色体(2n=60)占主体,所占比例为65%～91%,包括性染色体X、Y在内均为端着丝粒类型,染色体组的总相对长度为193.45,平均相对长度为3.22,未发现随体、次缢痕等特殊标志性特征。     

人胰岛素在乳腺细胞和组织中的高效生产

哺乳动物乳腺作为机体最大的分泌器官,被誉为是生物合成活性蛋白质和蛋白类药物的最有利场所。目前已有多个活性蛋白可以通过乳腺被高效的生产。然而,利用乳腺生产内分泌蛋白的效率却始终较低。乳腺中所含蛋白修饰酶种类的限制,对于内分泌蛋白的翻译后修饰存在一定的局限性。本研究以人胰岛素原基因为研究对象,通过基因工程技术将人胰岛素原基因中的两个内肽酶Ⅱ(endoproteasesⅡ,PC2)切割位点分别转变为乳腺可识别的内肽酶Ⅰ/Ⅲ(endoproteasesⅠ/Ⅲ,PC1/3)切割位点,构建乳腺特异表达载体,p BC1-663、p BC1-662和p BC1-792,并在乳腺细胞和小鼠模型中分别比较突变的人胰岛素原的表达对于胰岛素合成和分泌的影响。在细胞水平分析显示,表达突变型胰岛素原的细胞和培养液中的胰岛素含量显著高于对照组。进一步检测转基因小鼠泌乳期乳腺组织中胰岛素的含量显示,突变型人胰岛素原能够高效的在乳腺组织中合成人胰岛素,并高效的分泌到乳汁中。综上所述,将人胰岛素原蛋白内的蛋白酶切位点转变为乳腺内特有蛋白酶的酶解位点后,能够显著提高人胰岛素在乳腺细胞和组织中的合成和分泌效率。     

藏羚与几种牛科动物成纤维细胞的特性比较

为研究高原低氧环境对哺乳动物细胞生长特性的影响,本文以高原低氧动物藏羚和同科的阿尔巴斯白绒山羊、蒙古绵羊及鲁西黄牛的耳源组织细胞为材料,利用DMEM /F12 培养液进行培养,建立了4 种动物的体外培养成纤维细胞系,并对其进行形态学观察、生长曲线绘制、凋亡检测、核型分析等生物学特性检测。结果表明:4 种动物的细胞经差异贴壁法联合消化排除法,可获得纯化的成纤维细胞,细胞形态一致且活力稳定,4 种动物细胞的形态与生长曲线无明显差异;藏羚、绒山羊、绵羊、牛同代次细胞生长倍增时间分别为26 h、22 h、23 h 和22 h;经流式细胞仪检测,细胞凋亡率分别为5.5% 、2. 7% 、8. 6% 和1.5% ;藏羚、绒山羊、绵羊与牛的染色体数目分别为60、60、54 和60。藏羚与绒山羊、牛染色体数目相同,且除性染色体外,其余均为端部着丝粒类型,而绵羊存在6 条中着丝粒类型染色体。该结果表明,在体外培养条件下,藏羚的体细胞生长特性与同科的其他物种的细胞生长特性存在明显差异。这为从细胞水平上研究藏羚对环境低氧适应的分子机理提供了基础。