重组人gdnf乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究

为了制备重组人GDNF牛乳腺生物反应器,采用组织块贴壁法分离培养雌性牛胎儿成纤维细胞,连续继代培养75d,进行形态观察和染色体分析,在此基础上,转染带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双重筛选标记的重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF,G418筛选阳性抗性克隆,进行PCR法鉴定。结果表明,分离培养的牛胎儿成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖特性和染色体数目;目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。     

水牛胎儿成纤维细胞体外培养体系的初步建立

为探讨适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的体外培养体系,采用常规组织块法和胰蛋白酶消化法原代培养BFF均获得了较多的成纤维细胞,但后者所得细胞的活力不如前者高,且死细胞也较多;传代或冻存成纤维细胞时用4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化所得的细胞比37℃热消化的细胞更圆、更有光泽;跟踪32代的细胞冷冻复苏率均达70%～80%;染色体分析结果显示,二倍体细胞所占比例始终保持在80%～90%之间,各代细胞(5th、10th、15th)之间差异不显著(P>0.05).结果 表明,组织块法原代培养、4℃预冷胰蛋白酶室温消化传代细胞的培养体系比较适合水牛胎儿成纤维细胞的培养.     

牛成纤维细胞的分离与体外培养

研究了牛胎儿和成年牛皮肤组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征。通过组织块贴壁培养和分离单细胞接种培养均能获得原代牛皮肤细胞。用2.5 g/L胰蛋白酶+1mmol/L EDTA和5 g/L胶原酶I联合消化牛皮肤组织较2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化,得到更多的单个细胞,两者之间差异极显著(P<0.01),但其死细胞比率却有较大升高;2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化牛胎儿组织得到的单细胞数显著高于皮肤组织消化后得到的细胞数(P<0.01),死细胞比率也高于同种酶消化的皮肤组织。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化贴壁细胞后死细胞率明显高于用0.5g/L胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA消化的细胞(P<0.05);培养24 h后细胞贴壁率前者要明显低于后者(P<0.05)。用0.5 g/L胰蛋白酶轻度消化混杂生长的成纤维细胞和上皮样细胞,经过反复贴壁传代2～3代,可得到较纯的成纤维细胞。     

树鼩原代皮肤成纤维细胞的分离培养技术

建立稳定的树鼩(Tupaiabelangeri)皮肤成纤维细胞的体外培养体系,可为有关此类细胞的实验和疾病树鼩细胞模型提供技术支持。取树鼩大腿内侧皮肤用组织块贴壁法和胶原酶Ⅰ消化法分离皮肤细胞,胰蛋白酶差别消化法纯化细胞;用MEM(10%FBS)完全培养基和含低血清生长添加物(LSGS)的培养基培养细胞;免疫荧光和蛋白印迹法鉴定细胞,并测定细胞的生长、冻存和复苏特性。经树鼩皮肤细胞分离效果比较,胶原酶消化法比组织块贴壁法更适合用于树鼩原代皮肤细胞分离;对分离及冻存复苏后细胞生长状况观察比较发现,添加了LSGS的MEM培养基更利于细胞存活、生长;细胞形态观察、免疫荧光和蛋白印迹检测鉴定所分离的细胞为树鼩皮肤成纤维细胞。成功建立了树鼩原代皮肤细胞的分离、纯化方法,并优化了该细胞的培养条件。     

影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式,以高糖DMEM,添加0.1mM2-巯基乙醇,犊牛血清,细胞因子为培养基,以4-13周龄屠宰牛胎儿为实验材料,探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素,结果发现：当犊牛血清为15%时效果最好;细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著,而在传代过程中中有一定影响;以0.2%胰酶 0.04?TA为细胞消化液效果最佳;以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆牛胚胎干细胞,本研究观察到效果最好。     

乌珠穆沁白马成纤维细胞建系及其生物学特性分析

本研究以内蒙古乌珠穆沁白马(Equus caballus)雄性和雌性为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行耳组织成纤维细胞原代建系,研究耳组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制乌珠穆沁白马成纤维细胞核型图。实验结果显示,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞经组织贴壁法建系培养,生长为典型的成纤维细胞形态,并呈现“S”型生长曲线特征;细胞冷冻前后存活率存在显著差异,但仍具有较好的耐受冷冻性;根据染色体核型分析,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数为2n = 64,其中31对常染色体,1对性染色体。本研究成功建立了雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞系,并且得到可稳定培养、具有良好遗传学特性的细胞系,为后续的相关深入研究奠定了基础。     

牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染

为获得转基因克隆牛的供体细胞,采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,经2～3次传代纯化,绘制生长曲线,分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征。分别采用800、900、1000V／cm和1、5、10、15和20ms的参数组合,将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经800μg／mLG418筛选2周,继续以300μg／mLG418扩大培养2～3代,取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明,体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛,体外传代20次后核型未发生改变;转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达,筛选后各组克隆形成数以900V／cm和5ms组最多;PCR检测得到了预期条带,说明目的基因已经成功导入。分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体,进行转基因克隆研究。     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

水牛皮肤成纤维细胞的分离与体外培养

探讨水牛成纤维细胞的分离与传代培养方法。组织块培养法培养的成纤维细胞原代生长较慢,需12天左右方可汇合形成单层,而酶消化法培养的成纤维细胞原代生长相对生长快,仅需8天便可汇合形成单层。两种方法传代细胞的生长速度相似,仅需4-5天就可汇合形成单层。通过体细胞的核型分析发现,成纤维细胞在传代培养过程中的核型变化不大,66．67％～81．67％的细胞具有正常的二倍体核型,各代之间无显著差异。结果表明,水牛成纤维细胞均能稳定地进行传代培养。