人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA的构建及功能研究

目的:构建人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA并研究其功能.方法:人工合成编码mdrl小发夹状双链RNA的DNA片段,与pSilencer4.1-CMV质粒连接构建RNAi真核表达栽体,采用脂质体介导法转染人耐药白血病细胞K562/A,经潮霉素B筛选转基因阳性克隆细胞,RT-PCR和Western Blotting检测转基因细胞中mdrl基因的表达量,MTT法检测转基因细胞对阿霉素的敏感性.结果:RT-PCR结果显示,与未转基因组和阴性对照组比较,RNA干扰组mdrl基因在mRNA水平上表达量降低43.55%;Western Blotting检测显示,RNA干扰组mdrl基因在蛋白水平上表达量降低69.46%;MTT法检测显示mdrl干扰细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性提高23倍.结论:mdrl小发夹状RNA可显著抑制K562/A细胞中的mdrl基因的表达,提高白血病细胞对化疗药物的敏感性,对白血病多药耐药性的逆转和白血病的治疗具有重要理论和实际意义.     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

棉酚抗生育作用的研究 Ⅲ.大白鼠灌服棉酚后血液和有关脏器中棉酚含量的测定

大白鼠灌服棉酚后,棉酚在血液和有关脏器中的滞留是不等的,肝脏中浓度较高,累积也较快;血清、睾丸与附睾浓度较低,累积也较慢。但是,在较低的剂量条件下,这种累积是有限度的,即使长期灌服棉酚,也不会造成棉酚在体内无限制的累积;已累积的棉酚在体内滞留时间也并不长久,停药一段时间便可消失,大白鼠也逐渐恢复生育能力。剂量增大时,血液或肝脏中的棉酚浓度也在一定范围内成正比地增大。大量棉酚经肝-胆系统随粪排出,而且在一定剂量范围内有多食多排泄、少食少排泄的现象。     

白消安致大鼠无精子症模型的建立

目的:利用白消安建立SD(Sprague-Dawley)大鼠少精子症动物模型,为治疗人类男性不育症提供实验依据。方法:本研究取6周龄左右SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组通过腹腔注射不同浓度白消安(15、20、30、40、60 mg/kg体重),每个浓度分单次注射和连续10次累计注射两种方式,注射后每隔10d随机取样检测精子浓度、活力、畸形率以及曲细精管内部结构各项指标,30d出现弱精少精等不育症状后,第40d后停止取样,观察白消安对大鼠精子的作用效果。结果:单次注射15-60mg/kg剂量白消安都会使实验大鼠不同程度死亡,连续10 d累计注射剂量15 mg/kg白消安可破坏大鼠睾丸组织的部分精原干细胞,连续10 d累计注射总剂量20 mg/kg是较为理想的实验浓度,可消除全部精原干细胞和大部分支持细胞,30、40、60 mg/kg可致大鼠死亡或睾丸病变充血。结论:白消安对大鼠生殖细胞有毒害作用,通过腹腔注射一定浓度白消安可建立大鼠少精子症模型,可为外源干细胞体内转分化为生殖细胞提供准确的移植时间和实验依据。     

黄体酮对子宫内膜异位症在位内膜预处理与IVF治疗结局关系

摘要 目的：研究黄体酮对子宫内膜异位症在位内膜预处理改善IVF结局。方法：男性因素并卵巢子宫内膜异位囊肿168例,分两组：（1）实验组：IVF前自然周期月经第12天地屈孕酮30 mg/日、14天,3个月;（2）对照组：IVF前无干预。IVF前测血CA125,黄体期长方案促排卵,排卵后一周（垂体降调日）再测CA125并取子宫内膜行ER、PR、HOXA-10mRNA检测。HCG日测子宫内膜厚度、形态、血流。比较临床资料及结局、症状疼痛评分。结果：实验组胚胎种植率、临床妊娠率高于对照组（P<0.05）;HCG日对照组子宫内膜厚于实验组。实验组子宫内膜A型血流比率高于对照组（P<0.05）。实验组A型子宫内膜比率高于对照组,但无明显差异（P>0.05）;IVF前两组CA125均高于参考值,但无明显差异（P>0.05）。垂体降调日复查CA125,实验组明显低于对照组,实验组治疗后低于治疗前;实验组子宫内膜ER、PR、HOXA-10 mRNA表达量高于对照组,实验组分泌期子宫内膜比率高于对照组（P<0.05）;治疗后两组各项症状疼痛评分均较治疗前改善,且实验组优于对照组（P<0.05）。结论：IVF治疗中合并卵巢子宫内膜异位囊肿用黄体酮预处理在位内膜,可以降低血CA125,有利于转变子宫内膜组织类型、减小子宫内膜厚度、增加子宫内膜血流、增加子宫内膜ER、PR、HOXA-10 mRNA表达,改善在位内膜容受性,缓解症状疼痛,提高临床妊娠率。     

易感基因多态性与支气管哮喘的相关性研究

目的:探讨白介素-4(Interleukin-4,IL-4)基因589位点、白介素-4受体(interleukin-4 receptor,IL-4R)基因576位点多态性与内蒙古地区汉族支气管哮喘患者是否存在遗传易感性,是否与血清总IgE浓度相关.方法:采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测内蒙古地区62例支气管哮喘患者和30例汉族正常人群IL-4基因的589位点、IL-4R基因的576位点多态性,进行基因型和基因频率分析,同时采用Elisa法检测患者血清总IgE浓度.结果:哮喘组IL-4基因启动子区-589(C/T)位点多态性分布频率与对照组比较,两组间基因型频率分析(X2=3.437,P=0.179),无显著性统计学差异(P＞0.05);两组基因频率分析(X2=9.405,P=0.002),有显著性差异(P＜0.05).哮喘组IL-4R基因启动子区-576(Q/R)位点多态性分布频率与对照组比较,两组间基因型频率分析(X2=0.815,P=0.665),无显著性统计学差异(P＞0.05),两组基因频率分析(X2=0.245,P=0.621),无显著性差异(P＞0.05).哮喘组血清总IgE浓度高于对照组,有显著性差异(t=6.367,P=0.00,P＜0.05).结论:内蒙古地区汉族人群哮喘组中,IL-4基因启动子区-589(C/T)位点多态性与支气管哮喘的发病无显著性差异;IL-4R基因-576(Q/R)位点多态性与支气管哮喘的发病无显著性差异;患者组血清总IgE显著高于对照组,但是与IL-4基因启动子区-589(C/T)位点多态性和IL-4R基因-576(Q/R)位点多态性没有相关性.     

四氯化碳皮下注射制备肝纤维化模型的新设计

利用逐渐提高四氯化碳的浓度经皮下注射小鼠的方法,诱导肝纤维化形成,制作肝纤维化动物模型。经肝脏病理学检查、测定血清透明质酸(HA),证实此法能成功制作鼠肝纤维化模型,具费用低、易操作、死亡率低、成功率高等优点。     

人类Boule基因在减数分裂时期的生物信息学分析

Boule（boll）基因是DAZ基因家族的一个新成员,含有一个RNA结合域和一个DAZ重复域,是人类精子发生减数分裂过程中主要调控因子。为了研究Boule基因结构及其功能,利用生物信,息学方法对Boule蛋白相关结构、相互作用蛋白及其功能进行分析和预测。结果表明,Boule蛋白存在明显的亲水区、疏水区和卷曲螺旋;不存在信号肽、跨膜结构;主要分布在细胞质、细胞核、线粒体中;二级结构以α-螺旋、延伸链、无规则卷曲所组成,并含有非正规二级结构区;作用蛋白主要为CDC25A蛋白．功能域主要包含RRM保守域。Boule蛋白在精子发生过程中第一次减数分裂的生殖细胞中特异性表达,而在减数分裂完全阻滞的睾丸组织中不表达。因此,Boule蛋白功能可能与雄性生殖细胞减数分裂相关基因表达有关。     

体细胞核移植生产绵羊转hALR基因囊胚

扩增人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,利用质粒pIRES2-EGFP 构建新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体.LipofectAMINETM介导其转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,sFFCs);经G418筛选转基因细胞;激光共聚焦显微镜挑选绿色荧光单克隆细胞.PCR、RT-PCR和免疫组织化学方法进一步检测ALR基因及其表达;稳定表达外源基因的sFFCs作供体,移入去核的绵羊卵母细胞中,进行体细胞核移植.通过激光共聚焦显微镜和ALR抗体检测EGFP、ALR基因在胚胎水平上的表达,其结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因可在绵羊胎儿成纤维细胞内同时表达,由此细胞核移植产生的转基因胚胎在发育的各阶段均可见绿色荧光;囊胚中所有细胞表达EGFP基因;发绿色荧光的胚胎中ALR基因同时存在.因此,由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可简化检测目的基因的繁琐手段;用筛选的转基因早期胚胎进行移植,可提高制备转基因动物的效率.     

TGFα、EGF对绵羊卵母细胞成熟的影响

采用地衣红染色和免疫荧光的方法,观察了培养在基础培养液加BSA、血清、BSA EGF和BSA TGFα四组成熟培养液中绵羊卵母细胞的核成熟状态和α-微管蛋白分布,以及成熟培养后皮质颗粒(CG)的分布情况。结果表明培养22h的上述各组卵母细胞的核成熟率分别为63.5%、75.2%、73.1%、69.8%,处于第一次减数分裂末期的比率分别为27.0%、16.3%、15.9%、16.9%,EGF、TGFα和血清的添加明显提高了核的成熟率(P<0.05),显著减少了处于第一减数分裂末期的比例(P<0.05);α-微管蛋白的正常率(66.6%、66.6%、73.6%)也显著高于BSA组(43.3%)(P<0.05);CG发生迁移较好的卵母细胞比率分别为33.9%、58.8%、54.7%、47.9%,与BSA组相比,EGF和血清的添加明显促进了CG向皮质区的迁移(P<0.05)。实验表明TGFα和EGF均促进了绵羊卵母细胞成熟过程中从第一减数分裂末期向第二减数分裂中期的转变,并且能够替代血清中的某些成分促进和改善体外成熟卵母细胞核成熟的质量,EGF比TGFα更能促进绵羊卵母细胞胞质的成熟。