两种标记方法对60mer寡核苷酸芯片背景信号影响的初步分析

研究两种不同的样本标记方法对人全基因组高密度60mer寡核苷酸芯片背景信号的影响。收集5对患病与健康人外周血单个核细胞,分别提取总RNA后,采用限制性显示技术（restriction display,RD）进行样本双色（Cy3/Cy5）荧光标记,与5张Agilent 60mer高密度（22K）Human 1B寡核苷酸芯片进行杂交。芯片全部杂交点分3组：基因探针组、阳性对照组和阴性对照组。阳性对照采用荧光标记寡核苷酸直接掺入法进行标记。对全部杂交信号点的Cy3和Cy5背景信号值,用SPSS软件进行数据转换、正态性检验、方差齐性检验、变异系数分析和重复数据的方差分析。数据分析结果显示,Cy3 标记的背景信号值均高于 Cy5标记的背景信号值。重复测量数据的方差分析表明,在Cy3 和Cy5标记中,两种不同标记方法间的背景信号值的差异极显著（PCy3＜0.01, PCy5＜0.01）,且RD标记点的背景信号平均值低于荧光标记寡核苷酸直接掺入标记法标记的阳性对照点。RD标记方法是一种有用的低背景信号的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

人体特征的头发代谢组学及蛋白质组学研究进展

人类头发是以角蛋白和角蛋白相关蛋白为主要成分的天然纤维,是一种可表征一定时间内机体状态的良好生物学样本。头发易采集、低成本、易于运输和存储等优点使其在毒品、酒精及兴奋剂等的检测中具有独特优势。蛋白质组学是一种在整体水平上研究蛋白表达和调控的新兴技术,在生命科学领域应用广泛。蛋白质组学技术可用于不同人群头发蛋白组成及动态变化研究,在寻找疾病标志物、区分个人特质等方面具有巨大潜力。本文从头发的结构及组成、心理压力下头发的变化以及头发蛋白质组学分析技术的研究进展进行了全面综述,对理解头发蛋白质组学表征人体特征以及指导相关研究具有重要意义。     

三疣梭子蟹C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者。以甲壳类动物三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因"ptlyC";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-ptlyC,电转至毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33后,通过高浓度的博来霉素筛选到高拷贝酵母转化子;在28℃、250 r/min和pH6.0的条件下,经1%的甲醇诱导表达72 h,得到含重组ptlyC的培养液上清;经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化,得到分子量约为25.3 kD的纯化产物。通过菌落计数法证明含重组ptlyC的培养液上清具有抑制革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性;通过琼脂糖凝胶扩散法证明纯化的重组ptlyC具有抑制革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和沙门氏菌(Salmonella lignieres)的活性。     

三丁基锡和微囊藻毒素对小鼠肝脏p-Ezrin的影响简

正埃兹蛋白(Ezrin)是连接细胞膜和细胞骨架之间的膜细胞骨架连接蛋白,通过其C端、N端分别与细胞骨架和细胞膜蛋白结合,属于ERM(Ezrin-radixin-moesin)家族成员。由于Ezrin在细胞中的特殊位置,不仅在细胞的运动、黏附等正常生理活动中起重要作用,而且能调控黏附分子,参与癌细胞信号转导。Ezrin在细胞中有活化和失活两种状态,目前认为主     

基于头发蛋白质组学区分个人特质的方法学探究

目的 头发是一类重要的皮肤附属物，主要由角蛋白和角蛋白相关蛋白等组成。不同种族及性别样本的头发蛋白质组成和占比存在差异，且目前缺乏高效率提取头发蛋白的方法。本文探究基于定量头发蛋白质组学方法，旨在探索该方法区分不同个体的可能性。方法 以3例头发样本，对样品处理方法和裂解缓冲液进行探究，发展一种名为PLEE（PTM lab for protein extraction from hair with high efficiency）的稳定、高效的头发蛋白质提取方法，对7例人发样本，以PLEE法进行提取，结合胶内消化方法进行蛋白质组学实验，产出蛋白质组学数据，分析个体间的头发蛋白质组成及占比。结果 共鉴定274种蛋白质，共有的蛋白质107种，非共有蛋白质种类在57~119，部分样本存在独特鉴定蛋白。使用共鉴定107种蛋白质进行定量蛋白质组分析，通过聚类和主成分分析，可将各样本进行区分，且技术重复样本可聚在一起，表明流程的稳定性。另外，筛选出10个关键蛋白（KRT33A、KRTAP9-6、KRT83、KRTAP7-1、KRT32、BLMH、KRT38、KRTAP11-1、NPAS1、KRTAP4-3）在不同个体之间差异比较大且在同个体中蛋白质鉴定稳定。结论 不同个体的头发蛋白质组成存在差异，筛选出的10个蛋白质有望作为区分个体特质的关键蛋白，在个体识别、刑侦方面具有重大的应用潜力。     

外泌体蛋白质组学在肝癌发生发展和治疗研究中的应用进展

肝细胞癌 (Hepatocellular carcinoma,HCC) 是最常见的五大恶性肿瘤之一。据世界卫生组织 (World health organization,WHO) 最新统计,肝癌发病率位居全球第八,死亡率位居全球第三,严重影响人们的生命健康。外泌体 (Exosomes) 是磷脂双分子层包被的细胞外囊泡,携带来自母细胞的蛋白质、核酸等活性物质,可实现细胞间的物质交换和信息交流,参与协调体内的生理病理过程。近年来外泌体与肝癌相关性的研究引起了广泛关注,大量研究表明外泌体蛋白在肝癌的发生发展、诊断治疗和预后方面发挥至关重要的作用。现就外泌体的组成与功能、外泌体蛋白在肝癌的作用进行简要综述。     

太平洋牡蛎防御素在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性

防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,是软体动物抵御各种病原微生物侵染的重要免疫因子。太平洋牡蛎防御素(Crassostrea gigas defensin,CgD)近羧基端的43个氨基酸残基构成了其成熟肽区域,决定了CgD的生物学活性。首先通过逆转录PCR和设计特异性引物从太平洋牡蛎外套膜中分离并扩增到3?端添加和不添加6×His标签的两种目的基因CgDH~+和CgDH–;与pPICZαA连接后构建的重组表达载体(pPICZαA-CgDH~+和pPICZαA-CgDH–)电转至毕赤酵母Pichia pastoris X-33中,使用1.0%甲醇诱导表达目的蛋白CgDH~+和CgDH–,最适培养条件为29℃、250 r/min、72 h;通过固化金属离子亲和层析(IMAC)获得分子量为5.78 kDa的纯化的重组蛋白CgDH~+,根据其蛋白质浓度推算表达量为2.32 mg/L。经MALDI-TOF-TOF质谱分析证明纯化产物即为预期的目的蛋白。抑菌试验结果显示分别含重组蛋白CgDH~+和重组蛋白CgDH–的培养液上清对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa都具有抑菌活性,表明重组蛋白中6×His标签的存在与否并不影响其生物学活性。     

雷帕霉素对低氧下HL-60细胞的低氧调控信号分子表达的影响

摘要目的：通过小分子化合物氯（CoCt2）模拟的低氧环境,分析低氧下及其雷帕霉素（RPM）作用下人急性髓细胞白血病细胞HL．60的低氧调控信号分子表达的变化;方法：常规方法复苏、传代、培养HL-60细胞,培养细胞进入对数生长期后用于实验。低氧模拟组、低氧雷帕霉素处理组、常氧雷帕霉素处理组分别用含2001xmol／LCoCl2、2001xmol／LCOCl2／20nmol／LRPM、20nmol／LRPM的1640培养基处理生长状态良好的细胞,对照组细胞用1640培养基培养,各组置培养箱以37℃、5％CO2培养,并于处理后24h、48h、72h收集细胞用于检测;采用实时荧光定量PCR方法检测低氧诱导因子（HIF-1α）、内皮细胞生长因于（VEGF）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及GAPDH在转录水平的表达;结果：①与各时段对照组相比,低氧模拟组HIF-1α表达随时间逐渐增加,72h明显上调;与常氧雷帕霉素处理组各时段比较,低氧雷帕霉素处理组HIF-1α表达早期（24h）相对下调,后期相对上调;②．与对照组比较,各处理组mTOR表达均下调,低氧雷帕霉素处理组在早期（24h）下调显著;与常氧雷帕霉素处理组比较,低氧雷帕霉素处理组mTOR各时段的表达均相对下调;③与对照组各时段相比,低氧模拟组VEGF的表达在早期显著上调,但后期呈下调;常氧雷帕霉素处理组各时段VEGF的表达下调,与其比较,低氧雷帕霉素处理组各时段均呈相对下调。结论：常氧和低氧下RPM作用HL-60细胞后VEGF、mTOR的mRNA均表达下调,RPM可在低氧环境下增强了这种下调表达作用。     

厚壳贻贝Mytilin-1成熟肽在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性

贻贝素(Mytilins)是一类主要在贝类血细胞中表达的阳离子小分子抗菌肽,包括多种同工型,它们在免疫系统中发挥了重要作用,Mytilin-1是其中的一种同工型。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)Mytilin-1的一级结构由信号肽、成熟肽和C端的延伸肽组成;其成熟肽决定了Mytilin-1的生物学活性,它由34个氨基酸残基组成,其中8个保守的半胱氨酸残基在空间上能形成4对二硫键,对Mytilin-1的稳定性和活性起了关键作用。以厚壳贻贝的Mytilin-1成熟肽为重组DNA表达的目的蛋白,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性对编码该成熟肽的密码子进行优化,合成的目的基因"mMy1"与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母X-33,通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,获得的阳性转化子在29℃、250 r/min、pH6.0的条件下,使用1%甲醇诱导表达96 h;培养液上清经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析证明:重组mMy1在毕赤酵母X-33中得到成功表达,其分子量为4.8 kD。抑菌试验表明,重组mMy1对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherchia coli)具有抑菌活性。     

雷帕霉素对低氧下人HL-60细胞增殖和凋亡的影响

本研究拟通过小分子化合物氯化钴（CoCl2）模拟的低氧环境,探讨雷帕霉素（RPM）对该低氧下人急性髓细胞白血病HL-60细胞的生物学行为的影响。低氧模拟组、低氧雷帕霉素处理组、常氧雷帕霉素处理组HL-60细胞分别采用CoCl2、CoCl2／RPM、RPM进行处理,对照组为常氧下常规培养的HL-60细胞,处理及培养24h、48h、72h后收集细胞,采用倒置相差显微镜观察细胞生长状况,常规瑞氏染色后光学显微镜下观察细胞形态;MTT比色法检测各组细胞的活性和增殖能力;AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,与对照组细胞形态规则,胞核呈圆形或椭圆形相比,低氧模拟组和低氧雷帕霉素处理组细胞密度降低,生长明显受抑,细胞胞核呈不规则形或杆状,染色质粗糙,伴扭曲折叠等变化。各组间不同时问细胞增殖抑制率差异显著（P〈0．05）,低氧模拟组和低氧雷帕霉素处理组增殖抑制率随着处理时间延长而增大,且低氧雷帕霉素处理组的增殖抑制率大于低氧模拟组。与常氧下的对照组及雷帕霉素处理组比较,低氧的模拟组和雷帕霉素处理组诱导细胞发生较明显的凋亡,且后期72h低氧雷帕霉素处理组凋亡率显著高于模拟低氧处理组。以上结果表明,模拟低氧环境下,HL-60细胞生长明显受抑制,且诱导细胞凋亡;雷帕霉素可增强对低氧对细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。