绵羊卵母细胞的体外培养、受精与发育的观察

笔者等把屠宰母羊卵巢卵母细胞经体外培养成熟后用于体外受精,曾得到76.2—92.5％的受精率。本实验将体外成熟、受精后的羊卵在体外条件下继续培养或者在2—4细胞期移植给受体母羊之后,分别观察了培养卵的发育情况和移植羊的受胎率。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛 （英文）

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

组蛋白变异体H2A.Z的研究进展

H2A.Z是组蛋白H2A的变异体之一,是高度保守的组蛋白变异体,参与保护常染色体,防止形成异染色质;并且与转录调节、抗沉默、沉默和基因组稳定性有关。组蛋白变异体H2A.Z可能与染色体形成独立的结构域,从而调节染色质结构功能。但是,H2A.Z对染色体结构功能的作用机制还不是很清楚。组蛋白变异体H2A.Z和它的表观遗传修饰对染色体动态结构和功能起重要的作用。该文将对组蛋白变异体H2A.Z进行综述。     

奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化北大核心CSCD

通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。     

梅花鹿体细胞航天诱变后的生物学特性变化分析

本研究以自主研发的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)细胞培养技术进行了梅花鹿(Cervus nippon)体细胞的航天培养及生物诱变,并分析了其细胞在航天诱变后的生长曲线和核型特性。采用耳缘皮肤组织块贴壁培养的方法进行体细胞的原代培养;胰蛋白酶消化的方法完成细胞的传代培养;依照程序降温的方法完成细胞的冷冻保存;每天计数24孔板每孔的活细胞数并利用Excel 97-2003绘制出细胞的生长曲线,采用IBM SPSS Statistics 23统计软件回归分析程序中的非线性回归分析子程序Logistic曲线模型分析细胞生长曲线的拟合度;以常规染色体标本制备技术,利用细胞遗传工作站(AI)软件对梅花鹿体细胞的染色体核型进行分析。实验结果表明,新开发的PVDF膜细胞培养技术可有效保持梅花鹿体细胞在太空飞行过程中的存活并成功回收、传代建系。通过细胞传代培养观察发现,该体细胞经航天诱变后保持正常的成纤维细胞特征,生长曲线呈"S"型,航天诱变组体细胞在培养4 d进入对数生长期,与对照组体细胞在培养2 d进入对数生长期相比其细胞增殖速度减慢。拟合生长曲线分析表明,航天诱变组细胞生长拟合度值与对照组相似,但细胞增殖拐点时间、拐点细胞量分析结果证明,航天诱变后的体细胞增殖速度减慢。核型分析显示,航天诱变梅花鹿体细胞染色体数保持2n=66,染色体形态正常,核型为66(XX),其中32对常染色体,1对性染色体。本研究建立了哺乳动物在航天运行条件下的细胞培养PVDF新技术,并分析了航天诱变对于梅花鹿细胞生物学特性变化的影响,为以后进行相关研究提供了基础信息和技术支持。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列（IRES）连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统，用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法（900 V/cm, 5 ms）转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞，基因转染细胞在添加G418(800 μg/mL) 的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植，重构胚经体外培养至囊胚阶段，选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响，用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5% FBS)，然后恢复培养(10% FBS)10?h使细胞同步化于G1期，以正常培养的细胞作为对照进行核移植。 结果表明，转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2%, P<0.05)；转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响（23.2% VS 18.9%, P>0.05）。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛（每头移植2—4枚胚胎）中有一头妊娠，并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应（PCR）检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

Xist基因抑制对牛SCNT早期胚胎发育的影响

Xist是与X染色体失活相关的非编码基因,它在合子期基因组开始表达,是胚胎发育早期表达的第一个印记基因。探讨了特异性抑制Xist的TALER-REPRESSOR(TALER)载体转染到胎牛成纤维细胞对Xist基因的抑制作用,并以抑制Xist基因表达的细胞作为核供体制作克隆胚胎,研究Xist基因抑制对牛克隆胚早期发育的影响。结果显示,与对照组细胞相比,TALER载体将Xist相对表达量下调了93.85%,说明本试验设计的载体转染系统能够有效抑制Xist基因的表达。选取Xist抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植试验,克隆胚胎发育结果显示,试验组和对照组的卵裂率、8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率分别为78.8%vs 75.1%(P0.05,无显著差异)、54.4%vs 50.6%(P0.05,无显著差异)、12.3%vs 27.8%(P0.01,差异极显著)、0 vs 26.6%(P0.01,差异极显著)。综上所述,试实验设计的特异性抑制Xist表达的TALER载体可有效抑制雌性胎牛成纤维细胞中Xist的表达。供体细胞Xist这种基因下调可使克隆胚胎2-8细胞率略有提升,但囊胚期和桑葚胚率明显降低。因此,其机制尚待于进一步探讨。     

哺乳动物线粒体遗传和在体细胞克隆胚胎中的命运

线粒体是哺乳动物重要的细胞器之一,为细胞的生命活动提供能量.线粒体是除细胞核外唯一含有功能性基因组DNA的细胞器.由于线粒体在哺乳动物早期胚胎的发育中有多方面重要的作用,因此线粒体对体细胞克隆胚胎发育的影响成为体细胞克隆动物研究的热点.就线粒体的结构特点和遗传特性及其在同种、异种动物克隆早期胚胎发育过程中的命运以及可能的遗传机制进行综述.同时,也将比较注射异源线粒体后,线粒体在注射胚胎中的发育命运.     

小分子化合物诱导细胞重编程研究进展

细胞重编程指细胞内的基因表达由一种类型转变为另一种类型,通常包含两层含义:一是分化的细胞重新恢复到多能性或全能性状态;二是从一种分化的细胞转变为另一种分化的细胞。细胞重编程可为临床患者特异性细胞治疗提供无限的细胞资源。细胞重编程的途径有细胞核移植、转染特定转录因子、小分子化合物诱导等方法。核移植技术由于通常需要使用到卵子,而被认为存在伦理问题;转录因子的导入存在引起宿主基因突变的问题,限制了这一技术的临床应用。然而小分子化合物容易合成、细胞渗透性好,并且生物效应具有可塑性,使用小分子化合物诱导细胞重编程,避免了核移植的伦理问题和基因操作潜在的危害。目前,使用小分子化合物从体细胞诱导获得更安全的i PSCs(induced pluripotent stem cells),ci CMs(chemically induced functional cardiomyocyte cells)和ci NSLCs(chemical-induced neural stem cell-like cells)。对小分子化合物诱导细胞重编程,包括小分子化合物诱导多能干细胞;小分子化合物诱导潜能扩展的多能干细胞,以及小分子化合物诱导细胞转分化等方面的研究做了总结,并对小分子化合物诱导的未来发展做了展望,旨在为今后这方面的研究提供借鉴。     

乌珠穆沁白马成纤维细胞建系及其生物学特性分析

本研究以内蒙古乌珠穆沁白马(Equus caballus)雄性和雌性为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行耳组织成纤维细胞原代建系,研究耳组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制乌珠穆沁白马成纤维细胞核型图。实验结果显示,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞经组织贴壁法建系培养,生长为典型的成纤维细胞形态,并呈现“S”型生长曲线特征;细胞冷冻前后存活率存在显著差异,但仍具有较好的耐受冷冻性;根据染色体核型分析,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数为2n = 64,其中31对常染色体,1对性染色体。本研究成功建立了雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞系,并且得到可稳定培养、具有良好遗传学特性的细胞系,为后续的相关深入研究奠定了基础。