人干扰素ω(huIFN-ω)的高效表达、纯化及生物学活性

为了获得人干扰素-ω(huIFN-ω)在大肠杆菌中的高效表达,根据大肠杆菌的偏爱密码子,人工设计并合成了huIFN-ω高表达基因,并克隆到原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的15%左右,以包涵体形式存在.表达产物经变性、复性及阳离子和分子筛层析纯化,纯度达90%以上,产物的抗病毒活性约为1.0×108IU/mg,并具有体外促NK杀伤活性.此结果为进一步研究和开发重组huIFN-ω奠定了基础.     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶在大肠杆菌表达的研究

研究重组EB病毒胸苷激酶(thymidine kinase of Epstein-Barr virus,EBVTK)在大肠杆菌中的表达,将EB病毒的tk基因与原核表达载体pBV220进行重组,构成质粒pBV220/tk,并在大肠杆菌DH5α中获得表达;采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定,SDS-PAEG电泳和Western blot反应检测蛋白的表达。结果显示成功地构建了pBV220/tk质粒,并有重组蛋白的表达,该重组蛋白可与鼻咽癌病人血清发生特异性反应。结果表明该重组蛋白可作为抗原应用于鼻咽癌病人血清TKIgA抗体的检测,为重组TK的生产,临床应用提供了实验依据。     

表达产物可用IMAC快速纯化的原核表达载体的组建与应用

以原核高效表达载体pBV,220为骨架载体,采用互补寡核苷酸插入法在pBV220多克隆位点的上游插入了起始密码子和6组氨酸编码序列,将此新质粒命名为pBV222,以此载体表达的目的蛋白在N-段带有His6尾以利于IMAC层折快速纯化目的蛋白,酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将IL-2和GM—CSF cDNA克隆入pBV222载体中,表达的目的蛋白与预期的分子量相同,表达产物以包涵体的形式存在,表达量比非融合蛋白有明显的提高。且这种融合蛋白保留GM-CSF的生物学活性。表达菌体直接用6mol／L盐酸胍裂解或首先分离包涵体之后盐酸胍裂解,上清直接IMAC层析,以阶段性或线性pH梯度洗脱特异的目的蛋白。SDS-PAGE分析蛋白纯度在90％以上。     

rhHGFα重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :建立人肝细胞生长因子α链 (rhHGFα)高效原核表达体系 ,分离纯化rhHGFα蛋白 ,检测其生物活性。方法 :以pRC CMV hHGF为模板 ,扩增hHGFαcDNA继以XhoⅠ切为两个片段 ,亚克隆入pBSKS,测序后 ,将上述两个片段与pBV2 2 0连接 ,构建重组质粒。转化大肠杆菌 ,筛选高表达菌株。分离包涵体 ,8mol L尿素溶解 ,稀释复性后纯化重组蛋白 ,MTT法检测活性。结果 :测序证实所克隆的hHGFα基因序列正确 ,筛选出高效表达菌株E .coliBY ,SDS PAGE显示在相对分子量 5 2 0 0 0处出现特异的目的蛋白表达带 ,表达量约占全菌蛋白的 2 5 %。表达产物以不溶性的包涵体 (IB)形式存在 ,复性后具有刺激原代培养成年大鼠肝细胞生长的作用。结论 :以大肠杆菌为宿主 ,成功表达了hHGFα蛋白 ,为进行hHGFα结构与功能研究及中试生产奠定了基础。     

gAd重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。     

抗金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的原核表达及蛋白纯化

旨在将来源于鸡的金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)进行原核诱导表达,获得有抗体活性的目的蛋白。构建含有目的抗体基因的重组质粒,将此质粒进行原核诱导表达并鉴定所获得蛋白的生物活性。结果显示,(1)成功构建了含有金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的重组质粒p Cold I-scFv,质粒成功转化到大肠杆菌表达菌株中;(2)经过诱导表达后,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中;(3)使用4 mol/L尿素成功地将包涵体变性溶出;(4)通过柱层析法及透析法获得了纯化及复性效果较好的目的蛋白;(5)间接ELISA鉴定证实所获蛋白具有金黄色葡糖球菌抗体活性。通过质粒构建及原核诱导表达、包涵体溶出和复性等步骤,最终获得了有金黄色葡萄球菌抗体活性的目的蛋白。     

HIV-1融合蛋白MA4-CA在大肠杆菌中的高效表达

将HIV-1MA4-CA融合基因克隆到高效表达载体pBV220中,将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS—PAGE检测。结果表明,成功地构建了含MA4-CA融合基因的表达载体pBV220-MA4-CA,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为16000并以包涵体形式存在的融合蛋白,此蛋白经洗涤后能够溶于8mol／L的尿素中。利用硫酸铵沉淀法进行初步纯化后即可得到纯度比较高的MA4-CA融合蛋白,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

人Artemin cDNA扩增及表达

以人胎脑RNA为模板, 采用RT-PCR技术扩增人Artemin cDNA。序列分析表明, 扩增的人Artemin cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号：AF115765)同源性为99.7%, 氨基酸序列同源性为100%。将经过序列分析确定的Artemin cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中, 构建重组表达载体pGEX-6p-1-hART。通过SDS-PAGE分析重组人Artemin融合蛋白在大肠杆菌中的表达情况。结果表明, 重组人Artemin融合蛋白表达量约占宿主菌总蛋白的18.32%, 主要以包涵体形式存在。对表达的重组人Artemin融合蛋白包涵体进行溶解和复性, 并进行Western blotting分析。说明体外成功扩增人Artemin cDNA, 并在原核表达系统中高效表达了重组人Artemin融合蛋白。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61×103的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论:获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

IL-1ra-Fce融合基因的克隆、表达及鉴定

白细胞介素-1与免疫球蛋白E在过敏性哮喘发病中发挥着重要作用。本试验克隆了白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)及IgE分子恒定区cDNA片段, 构建了融合基因原核表达载体IL-1ra-Fce/pBV220。将其转化大肠杆菌BL21(DE3), 实现了融合蛋白的高效表达, Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白, 主要以包涵体形式存在; 利用分子筛和阳离子交换层析对表达产物经进行了纯化, 纯化的包涵体复性后经体外功能试验表明, 融合蛋白的活性与IL-1ra没有显著性差异; 初步药代动力学分析显示IL-1ra-Fce半衰期比IL-1ra延长了4.78倍。     

解毒酶基因cDNA克隆和高效表达

昆虫抗药性的一个重要机制是其产生的解毒酶可以将大剂量的农药脱去毒性[1] 。酯酶活性升高是库蚊对有机磷杀虫剂抗性的主要机制 ,与酯酶Ｂ1有关的抗性最高[2 ,3] 。酯酶与有机磷杀虫剂有非常强的结合力 ,可以迅速与之形成强结合体[4 ] 。酯酶的解毒作用具有很高的手性专一性 ,在有机磷化合物 ,特别是高毒的有机磷化合物的解毒作用中非常重要[1] 。高效表达解毒酶基因 ,将昆虫解毒酶用于人畜解毒的目的研究还未见报道。本文报道在大肠杆菌中高效表达昆虫解毒酶 ,并将产物用于实验动物有机磷中毒的解毒研究 ,为昆虫抗性相关基因的开发利用提…     

人角质化细胞生长因子-2基因的克隆、表达及产物的纯化、鉴定

用高表达菌株BL21codon plus compentent cells表达重组人角质化细胞生长因子(Hkgf-2)蛋白并初步纯化和检测其活性。通过RTPCR从流产胎儿肺组织中钓取hKGF-2cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21codon plus compent cells中表达hKGF-2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。结果显示,hKGF-2蛋白在BL21中得到高效表达;hKGF-2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖,具有显著的促有丝分裂活性。     

人白细胞介素22基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

白细胞介素 2 2 (ＩＬ 2 2 )是 2 0 0 0年发现的一种新的人类细胞因子 ,它在多种组织中均有表达 ,包括胰腺、脑 ,肝、小肠、直肠和肾等 .在功能方面 ,ＩＬ 2 2上调肝细胞急性期产物 ,参与炎症反应[1～ 3] ;诱导胰腺相关蛋白ＰＡＰ1 Ｒｅｇ2和ＯＰＮ的高表达 ,表明ＩＬ 2 2参与胰腺免疫功能反应[4 ] ;它对ＣｏｎＡ刺激下Ｔｈ1细胞ＩＦＮ γ的产生没有明显的抑制作用 ,却大大抑制了Ｔｈ2细胞ＩＬ 4的分泌 ,这对于哮喘有潜在的治疗作用[1] .我们利用反转录ＰＣＲ获得了编码ｈＩＬ 2 2成熟蛋白的ｃＤＮＡ ,并构建了高表达载体ｐＢＶｈＩＬ 2 2 ,…     

重组鼠干细胞因子的原核表达、纯化及生物活性初步分析

目的：研制重组鼠干细胞因子（rmSCF）,并检测其体外生物学活性。方法：提取BALB/c孕龄鼠总RNA,通过RT-PCR扩增mSCF的编码基因,将其克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,将重组菌株接种至氨苄青霉素抗性的LB培养基中,扩大培养至5L发酵罐中,42℃诱导表达,经包涵体复性、DEAE-SepharoseFF和Phenyle-SepharoseHP层析纯化,制备rmSCF。结果：构建了pBV220-mSCF原核表达载体,在大肠杆菌中表达了rmSCF,纯化后的rmSCF对类原巨核细胞白血病细胞系的UT-7细胞有明显的刺激作用,比活为1.0×106U/mg。结论：获得了纯度大于95%的rmSCF,将进一步展开其在小鼠体内的药效学研究。     

人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.     

鼠疫耶尔森氏菌VcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis)LcrV基因重组质粒pGEM－T／ypV酶切,克隆于原核表达载体pBV220,构建成pBV/ypV表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆,进行温控诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物,在相对分子质量38000处有－表达条带,经薄层扫描分析目的蛋白带占全菌蛋白的38．4％以上,主要以可溶形式存在。     

人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。     

Cloning and high-level expression of plasminogen activator inhibitor-1 cDNA derived from human glomerular mesangial cells

Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ1(ＰＡＩ1)ｉｓａｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｕｒｏｋｉｎａｓｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ(ｕＰＡ)ａｎｄｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ(ｔＰＡ)[1].ＣｈａｎｇｅｓｏｆＰＡＩ1ｍａｙｉｎｄｕｃｅｉｍｂａｌａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ(ＥＣＭ)ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ,ｔｈｕｓｌｅａｄｉｎｇ…     

原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。     

前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

15-羟基前列腺素脱氢酶（PGDH）属于抑癌基因,在多种肿瘤中表达缺失,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,测序鉴定正确后转化E.coli DH5α,经温控诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot,证实为相对分子质量约为29000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。经Ni2+配体亲和层析纯化得到纯度大于95%的目的蛋白。重组PGDH简单复性后具有一定的生物活性,约为3.7×104U/mg,为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。