呼吸道上皮细胞模型的研究进展

呼吸道病毒严重威胁人类的健康。呼吸道上皮细胞是机体防御呼吸道病毒和细菌等外来病原体的第一道防线,因此建立呼吸道上皮细胞体外分化模型,为研究呼吸系统疾病发病机理、筛选有效的治疗药物奠定基础。本文主要介绍人呼吸道上皮细胞原代培养技术的研究进展及其在呼吸道病毒和呼吸系统疾病方面的应用。     

干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究

IFN-β1b是大肠杆菌产生的17位Cys被Ser替换的人IFN-β的类似物,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了IFN-β-1b基因,插入质粒pBV220中,转化大肠杆菌DH5α.IFN-β1b的制备过程,包括发酵和一系列的纯化步骤.经修饰,IFN-β1b基因在启动子PRPL控制下发酵表达,合成的蛋白质以包涵体的形式存在.培养的细菌经收集、裂解后,将包涵体释放出来,包涵体经含SDS的溶液溶解,DTT还原.纯化过程包括有机溶剂抽提、分子筛层析、脱盐、氧化复性和反相层析,并用旋转蒸发除去有机溶剂.IFN-β-1b在不同种系来源的细胞上显示不同的抗病毒活性.     

猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究

猪是许多呼吸道病毒感染的天然宿主,其与人类在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都有相似之处。为了解呼吸道病毒感染机制和筛选呼吸系统疾病药物,选择以猪肺组织为原料采用无血清气液界面培养法构建一种猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell,PAEC)体外分化模型,然后通过扫描电子显微镜、电生理和免疫组织化学等方法鉴定该模型。采用三质粒共转染法构建重组腺相关病毒rAAV6-GFP(rAAV6-green fluorescent protein,rAAV6-GFP),通过顶端表面感染PAEC模型,探讨AAV6在PAEC模型中基因治疗领域的应用。结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底细胞。rAAV6-GFP能通过顶端表面感染PAEC,有效地介导外源基因的长期表达。本文建立的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型为呼吸道病原体感染和呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。     

AAV介导的H7N9单克隆抗体在体内高效表达

2013年,我国安徽、上海两地暴发了甲型流感病毒H7N9感染,造成了巨大的生命财产损失。至今仍无可用H7N9疫苗上市。近来,研究人员鉴定了多株H7N9中和抗体。但由于抗体在体内半衰期较短,限制了其作为长效预防手段控制H7N9感染的作用。AAV(Adeno-associated virus)作为基因治疗载体,具有低免疫原性的特征,并可介导外源基因在体内长期稳定表达。本实验中,我们利用重组AAV介导H7N9的两种单克隆中和抗体HNIgGD5和HNIgGH8在体内长期高水平表达以预防H7N9的感染。结果显示,我们所构建的重组AAV-抗体表达系统可以在细胞水平和实验动物体内介导病毒中和抗体高水平表达。其中在小鼠体内HNIgGD5表达量达到199.9μg/mL,HNIgGH8高达430.9μg/mL。这将为利用中和抗体预防H7N9感染提供新策略。尤其是对于疫苗非适用人群,如免疫缺陷患者、老人、儿童和孕妇等预防流感入侵具有重要意义。