一种小肽的多顺反子串联表达方法

目的：构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,简写为Ecs) 多顺反子串联多拷贝基因。方法：以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒,在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导表达,18% SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。结果：Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%,实现了Ecs的串联表达。结论：Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。     

RNA干扰技术对PC12细胞CaMKⅡβ基因表达的影响

观察RNA干扰表达载体对PC12细胞中CaMKIIβ基因的抑制作用。构建针对CaMKIIβ基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot 检测其对CaMKIIβ mRNA及蛋白质水平的影响。构建的质粒表达载体在PC12细胞中抑制了CaMKIIβ mRNA及蛋白质的表达。与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对CaMKIIβ mRNA的抑制率48h、72h分别为46.40％、64.69％,蛋白抑制率72h约为74.77％。RNAi表达载体可以有效地抑制PC12细胞CaMKIIβ基因的表达。     

PBI-SUR-TK载体靶向介导HSV-TK自杀基因诱导肝癌细胞凋亡

目的:构建Survivin启动子调控的表达载体,并检测在启动子调控下HSV-TK自杀基因对肝癌细胞HepG₂和正常肝细胞HL-7702凋亡的影响。方法:合成含TK基因的质粒PBI-SUR-TK,利用脂质体Lipofectamine 2000将其导入肝癌细胞和肝细胞。然后分别运用RT-PCR和Western blot特异性检测基因和蛋白的表达情况;利用CCK8方法检测细胞增殖情况,流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。结果:肝癌细胞转染组有更多的TK基因表达产物,增殖情况减弱,凋亡情况明显。结论:Survivin启动子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌可能有一定的治疗作用。     

基因重组Echistatin发酵工艺的优化

目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响,利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品,并鉴定和检测Ecs活性。结果:经过高密度发酵优化后,菌体湿重可达110g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的40%;亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为68mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。结论:通过发酵和纯化工艺优化,大大提高了目的蛋白产量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。     

gAd重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。     

人血小板因子4在大肠杆菌中的高效表达及活性研究

为了提高人血小板因子 4(humanplateletfactor 4,hPF4)的表达 ,在PT7 7 hPF4表达质粒的基础上 ,采用PCR定位突变技术 ,改造人血小板因子 4(hPF4)cDNA基因片段 ,去除cDNA 3′端非翻译区AT富含序列 ,改用大肠杆菌强串联终止密码子TAATAA ,成功构建了高效表达质粒pBV2 2 0 hPF4。摇瓶发酵重组人血小板因子 4的产量达 1 60mg L较原表达质粒PT7 7 hPF4表达量提高了近 80倍。经包涵体的洗涤、变性、复性后 ,采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验测定复性后rhPF4的生物学活性 ,结果显示 :rhPF4具有抑制血管生成活性。     

基于处方挖掘与分子动力学模拟筛选严重急性呼吸综合征冠状病毒2潜在抑制剂分子的研究

目的 从中药筛选具有潜在抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2 （SARS-CoV-2） 活性的成分，进一步从原子水平揭 示其抑制SARS-CoV-2 表面刺突蛋白（S 蛋白） 受体结合域（RBD） 与血管紧张素转化酶2 （ACE2） 结合的内在机制。 方法 检索新型冠状病毒（简称“新冠肺炎”） 治疗中药处方，构建“新冠肺炎中药候选活性成分数据库”。用具有ACE2 抑制活性的小分子化合物构建HipHop药效团模型，并对“新冠肺炎中药候选活性成分数据库”中活性成分筛选。采用分子 对接和分子动力学模拟方法研究候选活性成分与ACE2 的结合方式及其对SARS-CoV-2 S 蛋白与ACE2 识别的影响。 结果 本文通过中药处方挖掘和分子动力学模拟，从143 个新冠肺炎治疗中药处方中筛选出10 种可与SARS-CoV-2 S 蛋白/ 人源ACE2 识别位点结合的中药成分。其中，枇杷叶主要活性成分23-trans-p-coumaryhormentic acid 与ACE2 具有最高的亲和 力，且23-trans-p-coumaryhormentic acid 的结合可有效阻断SARS-CoV-2 S蛋白与宿主细胞ACE2 的结合。结论 本文通过虚 拟筛选发现了SARS-CoV-2 潜在抑制剂分子23-trans-p-coumaryhormentic acid，同时从原子水平预测了其抑制SARS-CoV-2 S 蛋白与ACE2 结合的内在机制，这将为SARS-CoV-2 特异性抗病毒药物的研发提供理论依据。     

siRNA对神经肽Y诱导的大鼠心肌细胞肥大Ca2+/CaM-CaN通路的影响

采用差速贴壁法体外原代培养大鼠心肌细胞;NPY刺激培养的心肌细胞增殖;RNA干涉特异性抑制CaN的活性,阻断NPY刺激的心肌细胞中Ca2 /CaM-CaN信号转导通路;观察对CaN活性、表达水平和心肌细胞蛋白合成速率的变化.实验结果显示NPY可增加心肌细胞的CaN活性和表达,加快细胞内蛋白合成速率.RNA干涉抑制CaN活性后,明显降低NPY刺激的蛋白合成速率.CaN参与了NPY刺激的心肌细胞增殖,RNA干涉通过抑制CaN的活性可阻断N PY诱导的心肌细胞肥大Ca2 /CaM-CaN通路.