一种小肽的多顺反子串联表达方法

目的：构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,简写为Ecs) 多顺反子串联多拷贝基因。方法：以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒,在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导表达,18% SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。结果：Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%,实现了Ecs的串联表达。结论：Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。     

人血小板因子4在大肠杆菌中的高效表达及活性研究

为了提高人血小板因子 4(humanplateletfactor 4,hPF4)的表达 ,在PT7 7 hPF4表达质粒的基础上 ,采用PCR定位突变技术 ,改造人血小板因子 4(hPF4)cDNA基因片段 ,去除cDNA 3′端非翻译区AT富含序列 ,改用大肠杆菌强串联终止密码子TAATAA ,成功构建了高效表达质粒pBV2 2 0 hPF4。摇瓶发酵重组人血小板因子 4的产量达 1 60mg L较原表达质粒PT7 7 hPF4表达量提高了近 80倍。经包涵体的洗涤、变性、复性后 ,采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验测定复性后rhPF4的生物学活性 ,结果显示 :rhPF4具有抑制血管生成活性。     

双胸蚓纤溶酶的纯化及性质

 用硫酸铵分段盐析、超滤膜分级分离及DEAE-纤维素、Sephadex A-25和Sephadex G-50三种柱层析方法从双胸蚓组织的粗提取液中分离纯化出一种纤溶酶,分子量为29kD,由一条肽链组成。此晦具有强烈的溶解纤维蛋白的作用,对家兎实验性血凝块也具有明显的溶解作用。此酶的最适pH为8.0,在pH7.6～8.4之间活力相差不到2％;酶在PH4.7—11.0范围内稳定;酶作用的最适温度为57℃;此酶热稳定性较好,于25～50℃保温3小时,酶活力基本不变,60℃时,活力保留65％。金属离子Na~(+)、K~(+)、Mg~(2+)等可提高此酶的活力,而Hg~(2+)、Ca~(2+)等金属离子对此酶有不同程度的抑制作用。     

口腔白斑组织癌变标志性基因筛查

口腔黏膜白斑病（oral leukoplakia,OLK）是最常见的口腔粘膜的癌前病变．OLK恶性转化率高达43%,因此加强其风险调查和监测对于该病的预防和治疗具有重要意义．本研究采用美国SuperArray公司的肿瘤基因芯片（OHS-802）检测口腔正常组织、OLK组织和口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC)组织的肿瘤相关基因表达差异,旨在筛查与口腔黏膜白斑病发生和癌变相关的表达阳性基因,为探究OLK的发生及癌变机制奠定基础．将“正常组织→OLK组织→OSCC组织”连续递增2倍以上或递减2倍以上的基因确定为OLK组织癌变的标志性基因．SuperArray基因芯片、RT-PCR法和实时定量PCR结果显示,仅有3个基因（ACP-2、BCL-2、SOCS-3）表达水平连续下调2倍以上,有6个基因（CLK-3、CTNNB-1、FKBP-8、GDF-15、NF-1、XRCC-1）表达连续上调2倍以上．进一步经RT-PCR和实时定量PCR验证,其结果与SuperArray结果一致．本研究结果提示,ACP-2等9个基因可能是口腔正常黏膜组织经OLK转变为癌组织的驱动基因,可作为OLK组织、OSCC组织和口腔正常黏膜组织诊断的分子标志．     

一种构建多拷贝串联小分子多肽基因的方法

目的:构建蛇毒锯鳞蝰血抑环肽(Ecs)基因串联多拷贝重组质粒。方法:采用重叠延伸PCR克隆Ecs基因,将第28位Met的密码子突变为Leu,利用其序列特点及酶切位点,在表达载体pET30a上将Ecs基因以同向串联方式连接,在E.coliBL21(DE3)中表达产物。结果:工程菌表达的串联Ecs与预期结果相符,实现了Ecs基因的串联表达。结论:为活性小肽的体外表达提供了新的思路和方法。     

前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

15-羟基前列腺素脱氢酶（PGDH）属于抑癌基因,在多种肿瘤中表达缺失,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,测序鉴定正确后转化E.coli DH5α,经温控诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot,证实为相对分子质量约为29000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。经Ni2+配体亲和层析纯化得到纯度大于95%的目的蛋白。重组PGDH简单复性后具有一定的生物活性,约为3.7×104U/mg,为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。     

新型神经保护肽[Gly14]-Humanin的表达，纯化和活性鉴定

Humanin（HN）是近年来在人体内发现的内源性多肽,能够保护神经细胞免于各种阿尔采默病病相关因素诱导的凋亡,HN肽链第14位氨基酸被Gly取代的突变体[Gly14]-Humanin（HNG）,神经保护活性比HN高近1 000倍。但由于HNG天然获取的途径有限,限制了对其功能的进一步研究。本课题组构建了HNG的表达质粒pET32a/HNG,并将其转化大肠杆菌BL21 trxB (DE3),诱导表达后HNG以可溶性融合蛋白的形式出现并用镍离子亲和层析纯化,纯化的融合蛋白用肠激酶切割后经反相层析得到纯化的HNG多肽（23 mg每1 L细菌培养液）,重组HNG多肽的分子量经电喷雾电离质谱（ESI-MS）检测为2876.5道尔顿,其N末端8个氨基酸残基的序列经Edman降解法测定为A-M-M-A-P-R-G-F,均与理论值一致。神经细胞保护实验表明,重组HNG多肽的神经保护作用与天然的HNG相近     

人纤溶酶原饼环区5(hPK5)基因的分泌型表达

构建人纤溶酶原饼环区5(hPK5)基因的原核可溶性表达载体并进行表达和纯化,获取大量高纯度、具有生物活性的hPK5蛋白。以纤溶酶原cDNA为模板,PCR扩增了hPK5基因,经过适当酶切后构建表达载体pET22b(+)hPK5,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达并经组氨酸亲和层析获得纯化。带有重组质粒pET22b(+)hPK5的大肠杆菌经IPTG诱导后以可溶性形式表达16kDa的蛋白,其表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有Histag抗原活性。构建了pET22b(+)hPK5重组质粒并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量hPK5基因工程产品奠定了实验基础。     

蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。