微小腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应, 延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间, 制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ, 同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照. 经CsCl超离心纯化, AdGTi’Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8%. 分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞, hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3) μg/(10⁶∙24 h)和(1.4±0.2) μg/(10⁶∙24 h). 血友病B小鼠分别腹腔注射1×10¹⁰ pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ, 小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690 ng/mL, 表达时间分别持续了16和10周. 与血友病B小鼠相比, 出血时间从原来的超过30 min缩短到7.5 min, 5 min内失血量从原来的430 μL减少到60 μL. 免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明, 微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比, 在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低. 结果表明, 微小腺病毒与第1代腺病毒相比, 同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达, 而且在动物体内的表达时间上有所延长, 病毒引起的免疫反应强度则明显降低, 为进一步的研究提供了实验依据.     

血红素加氧酶-1可能经诱导 foxp3+CD4 +CD25 + Treg细胞抑制哮喘气道炎症

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)作为体内保护蛋白, 在哮喘气道炎症中具有显著的抗炎作用. foxp3+CD4 ⁺CD25 ⁺ T调节细胞(T regulatory cells, Treg)是调节性细胞的主要组成部分, 以抑制的方式调控其他效应细胞的活性和功能. IL-10是多种细胞分泌的抗炎细胞因子, 具有免疫抑制功能. 本研究探讨HO-1诱导foxp3 ⁺CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 增加IL-10分泌以拮抗哮喘气道炎症. 选用磁珠分离CD4⁺CD25⁺ Treg, 含 HO-1 质粒转染或血红素(Hemin)和锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin, SnPP)处理, RT-PCR和Western blot方法检测显示Hemin上调HO-1表达, CD4⁺CD25⁺ Tregfoxp3 表达及蛋白水平显著增加, ELISA方法测定上清液IL-10水平明显升高. 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏、激发的哮喘小鼠, Hemin上调HO-1表达, 肺和脾脏中foxp3表达及蛋白量亦增加, 血清IL-10增高, 而OVA特异性IgE水平降低. 肺病理组织学检测、支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid, BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)计数均显示炎性细胞尤其是EOS浸润减少; CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg功能抑制实验发现, OVA致敏、激发Balb/C小鼠经Hemin干预后, 抑制作用显著增加; SnPP能逆转HO-1作用. IL-10剔除的B6.129P2-Il10^tm1Cgn/J小鼠Treg抑制作用经Hemin干预后仍未改善. 但体内外实验发现TGF-β水平无变化. 本研究表明: HO-1可能经诱导CD4 ⁺CD25⁺ Treg 特异性转录因子foxp3表达, 激活CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 促进IL-10分泌, 以拮抗哮喘气道炎症.     

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量

观察p18^INK4C (p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18^-/-)纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18^+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18^-/-细胞与p18^+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

孕酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外实验模型,分别添加10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10 mol/L孕酮,运用实时荧光定量PCR方法测定孕酮对上皮细胞内β-防御素相对表达量的影响。结果显示,与对照组比较,10^-6和10^-7 mol/L孕酮组β-防御素相对表达量显著升高（P<0.05）;10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著升高（P<0.01）;而10^-10 mol/L孕酮组未见显著性差异。孕酮添加组间比较显示,10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著高于10^-10 mol/L组（P<0.01）,其它孕酮添加组间未见显著性差异。分析认为,一定浓度的孕酮（10^-9－10^-6 mol/L）对培养的输卵管上皮细胞β-防御素的表达有促进作用。且不同浓度的孕酮对β-防御素表达的影响程度不同。因而推断,雌性生理周期下,雌性生殖道β-防御素的表达与孕激素相关。     

新的红细胞分化相关基因EDRF1功能的初步研究

曾报道过通过功能筛选得到一个新的红细胞分化相关基因, 并命名为EDRF1(erythroid differentiation related factor 1, GenBank登录号为AF040247). 鉴于功能线索明确, 选择K562细胞作为模型细胞, 通过基因转染技术观察了EDRF1反义RNA表达和EDRF1过表达对细胞增殖和分化的影响, [³H]TdR掺入和半固体集落培养实验的结果显示EDRF1过表达时, 细胞增殖代谢能力有所下降. Northern印迹和RT-PCR的结果表明, 反义EDRF1表达载体转染后的K562细胞α-globin, γ-globin mRNA表达水平下降, STAT3, c-myc, GATA-1表达下调, 红细胞生成素受体(EpoR)在反义表达载体转染后表达有一定程度的上调. 说明EpoR和珠蛋白的表达调节没有内在的正协同关系, EDRF1对K562细胞增殖和分化的调节有可能是通过影响GATA-1等诸多红系特异的转录因子与顺式序列相互作用的转录活性实现的.     

胰腺十二指肠同源框-1基因促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞

虽然骨髓间充质干细胞(BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells)具有极强的自我更新能力及多向分化潜能, 但最近发现其体外分化为胰腺内分泌细胞的效率并不高, 不能产生足够用于移植的胰岛样细胞. 胰腺十二指肠同源框-1基因(Pdx-1, pancreatic duodenal homeobox-1)在胰腺胚胎发育和胰岛素基因表达调控方面均具有重要作用, 因此构建含有Pdx-1的真核表达载体, 并使用新型纳米介质Superfect介导重组载体转染BMSCs, 研究Pdx-1表达在BMSCs体外分化为胰岛样细胞中的作用. 结果表明, 转染重组载体后(Pdx-1⁺ BMSCs)分化为胰岛素阳性细胞比例为(28.23±2.56)%, 较转染空白载体和未转染组(Pdx-1-BMSCs)明显增多(分别为(7.08±2.69)%和(4.59±3.02)%); 细胞免疫化学染色显示诱导后细胞表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素蛋白, 而且Pdx-1⁺ BMSCs诱导后表达明显增加, 与Western blotting和RT-PCR结果相似; 葡萄糖诱导的胰岛素分泌量测定显示Pdx-1⁺ BMSCs对不同浓度葡萄糖有不同的胰岛素分泌, 25和5.5 μmol/L葡萄糖刺激后胰岛素分泌量分别为(115.29±2.56)和(56.61± 4.82) μU/mL, 明显高于Pdx-1^- BMSCs分泌量(分别为(53.26±7.56)和(25.53±6.49) μU/mL). Pdx-1⁺ BMSCs分化的细胞同种异体移植后可以恢复糖尿病模型大鼠的血糖水平, 移植物平均存活时间(30.5±15.7)天. 本试验提示大鼠BMSCs体外能分化为胰岛样细胞; Pdx-1能显著增强上述分化能力; BMSCs体外分化的胰岛样细胞移植能改善STZ糖尿病大鼠的生存状态. 这将为糖尿病的治疗提供一条新的途径.     

Photo-induced electron transfer between hypocrellins and nano-sized semiconductor CdS——EPR study on the kinetics of photosensitized reduction in HA-CdS and HB-CdS systems

Both HA-CdS and HB-CdS (Hys-CdS, Hys represents HA, HB) complex systems were established according to the dynamics of heterogeneous electron-transfer process ＜0. In these systems, the electron transferring from ¹Hys^* to conduction band of CdS is feasible. Determined from the fluorescence quenching, the apparent association constants (K_app) between Hypocrellin A (HA), Hypocrellin B (HB) and CdS sol. were about 940 (mol/L)^-1, 934 (mol/L) ^-1 , respectively. Fluorescence lifetime measurements gave the rate constant for the electron transfer process from ¹HA^*, ¹HB^* into conduction band of CdS semiconductor as 5.16×10⁹ s ^-1, 5.10×10⁹ s ^-1, respectively. TEMPO (2,2,6,6-tetramethy-1-piperdinyloxy), a stable nitroxide radical, was used in the kinetic study of the reduction reaction taking place on the surface of a CdS colloidal semiconductor, kinetics equation of the reaction was determined with the electron paramagnetic resonance (EPR) method, and the reaction order of TEMPO is zero. When Hys were added, the rate of EPR increased greatly. By comparing rate constants, the Hys-CdS systems were revealed to be about 350 times more efficient than CdS sol. alone in the photoreduction of TEMPO under visible light. It suggests that Hys can be used as efficient sensitizers of a colloidal semiconductor in the application of solar energy.     

亚热带杉木和马尾松群落土壤系统呼吸及其影响因子

 亚热带杉木(Cunninghamia lanceolata)和马尾松(Pinus massoniana)在我国森林资源中占有十分重要的地位, 研究它们的土壤与表层凋落物的呼吸有助于了解它们的碳源汇时空分布格局及碳循环过程的关键驱动因子。采用Li-Cor 6400-09连接到Li-6400便携式CO2/H2O分析系统测定湖南两种针叶林群落(2007年1月至12月)的土壤呼吸及其相关根生物量和土壤水热因子。研究结果表明: 杉木和马尾松群落中土壤呼吸的季节变化显著, 在季节动态上的趋势相似, 都呈不规则曲线格局, 全年土壤呼吸速率平均值分别为186.9 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1和242.4 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1。从1月开始, 两种群落的土壤呼吸速率由最小值33.9 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1和38.6 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1随着气温的升高而升高, 杉木群落到7月底达到全年中最大值326.3 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1, 而马尾松群落到8月中旬达到最大值467.3 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1, 土壤呼吸的季节变化与土壤温度呈显著的指数相关, 土壤温度可以分别解释土壤呼吸变化的91.7%和78.0%, 和土壤含水量呈二次方程关系, 土壤含水量可以解释土壤呼吸变化的5.4%和8.4%。由土壤呼吸与土壤温度拟合的指数方程计算Q₁₀值, 杉木和马尾松群落中全年土壤呼吸的Q₁₀值分别为2.26和2.13, Q₁₀值随着温度升高逐渐减小。两种群落土壤呼吸的差异主要受群落植被的根生物量、群落的凋落物量的影响。     

芦丁、槲皮素快速修复嘌呤脱氧核苷酸阳离子自由基

利用脉冲辐解技术研究了芦丁和槲皮素对嘌呤脱氧核苷酸阳离子自由基的修复作用. 脉冲辐照经N²饱和的含20 mmol/L K²S²O⁸, 200 mmol/L t-BuOH及芦丁或槲皮素的脱氧核苷酸中性水溶液, 几十个微秒内出现芦丁或槲皮素酚氧自由基的瞬态吸收谱, 同时先前形成的脱氧核苷酸阳离子自由基的瞬态吸收谱迅速衰减, 表明被试黄酮能够快速修复脱氧核苷酸阳离子自由基. 对dAMP和dGMP阳离子自由基的修复反应速率常数分别为(3.8 ~ 4.4)×10⁸和(1.3 ~ 1.8)× 10⁸ L/(mol·s).     

血红素加氧酶-1介导CD4+CD25High调节性T淋巴细胞拮抗哮喘气道炎症的实验研究

探讨血红素加氧酶-1(HO-1, heme oxygenase-1)介导CD4⁺CD25^High调节性T淋巴细胞(Treg, regulatory T cells)拮抗哮喘气道炎症的作用. 用卵清蛋白(OVA)致敏、激发小鼠制备并建立哮喘动物模型, 并在致敏、激发过程中经氯化高铁血红素(Hemin)或锡-原卟啉(SnPP, Sn- protoporphyrin)处理. 分别测定激发后各组动物血清OVA特异性IgE, 支气管肺泡灌洗液中(BALF, bronchial alveolar lavage fluid)细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS, eosinophil)数及外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞变化和肺组织HO-1和Foxp3 mRNA表达量, 结合病理切片分析气道炎症状况. 结果显示: OVA组、Hemin组、SnPP组血清OVA-特异性IgE和BALF中细胞总数及EOS数明显高于正常对照组, 但Hemin组IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数明显低于OVA组; 而OVA组和SnPP组间IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数无显著性差异; 病理组织学显示OVA组、Hemin组和SnPP组气道组织均见EOS浸润, 但Hemin组气道炎症仍明显轻于OVA组和SnPP组; Hemin组外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞比例及肺组织Foxp3 mRNA相对表达量明显高于OVA组. Hemin显著上调HO-1表达. 实验表明, 用Hemin诱导HO-1高表达后外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞比例及Foxp3 mRNA相对表达量明显升高, 同时血清OVA特异性IgE明显下降, BALF中细胞总数和EOS数减少, 气道炎症减轻; 提示HO-1可通过提高CD4⁺CD25^High Treg细胞比例并增强其功能来调节体内Th1/Th2平衡, 在支气管哮喘中起到保护作用.     

封闭CD28-B7和OX40-OX40L共刺激通路诱导异种胰岛移植物耐受的研究

抑制T细胞的活化可以有效延长移植物的存活时间. 研究表明, 在体外混和淋巴细胞反应体系中分别加入CTLA4Ig和OX40Ig蛋白, 可以强烈地抑制T细胞的增殖. 用链脲佐菌素(200 mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病小鼠, 在进行胰岛移植的-1天, 经尾静脉输注5×10⁸ pfu AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig, 胰岛移植物的存活时间明显延长(100.3±14.94)天, n = 6, 并对外源性葡萄糖的刺激反应正常, Th1型细胞分泌细胞因子的能力明显受到抑制, 表明重组腺病毒AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig在小鼠体内可以高效地表达CTLA4Ig和OX40Ig分子, 并且诱导对大鼠胰岛移植物的耐受, 提示其在器官移植耐受的诱导中具有潜在的应用价值.     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力

以鹅源H5亚型禽流感病毒(AIV)基因组为模板,用RTPCR扩增血凝素（Hemagglutinin, HA）基因,克隆入鸡痘病毒表达载体pFG1175,转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞,通过蓝斑筛选和间接免疫荧光检测,获得表达HA基因的重组鸡痘病毒（Recombinant fowlpox virus, rFPVHA）。rFPVHA经鸡胚成纤维细胞连续传15代后,报告基因LacZ和HA基因可稳定表达。用103PFU和105PFU的rFPVHA免疫无特定病原体的(Specific pathogen free, SPF)鸡,免疫后22d 血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)抗体监测阳性率分别为0%和20%,但均抵御了H5亚型毒株的致死性攻击,保护率为100%。结果表明,构建了表达HA基因的重组鸡痘病毒,该重组病毒具有良好遗传稳定性,免疫鸡可提供完全保护,显示出了一定的应用前景。     

距树干不同距离处华北落叶松人工林细根生物量分布特征及季节变化

 该文研究了华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)人工林细根生物量水平分布和季节变化特征。采用钻土芯法(土钻内径7.0 cm), 在距树干20、50和100 cm处设取样点, 每个样点处分3层(0~10、11~20和21~30 cm)钻取土芯, 取样时间为5、7、9和10月。华北落叶松人工林细根(≤2 mm)生物量全年平均值为224.89 g&#8226;m^–2, 在水平分布上表现为100 cm处细根生物量最大(244.20 g&#8226;m^–2), 其次为20 cm处(221.03 g&#8226;m^–2), 50 cm处最少(209.45 g&#8226;m^–2)。在0~30 cm土层, 总细根(包括活跟和死根)生物量季节变化范围在169.67~263.09 g&#8226;m^–2之间, 9月细根生物量最大, 5月细根生物量最少。0~10 cm土层细根生物量季节变化差异显著(p＜0.05), 11~20和21~30 cm差异不显著(p＞0.05)。距树干100和20 cm处(0~10 cm土层), 细根生物量的季节变化差异明显(p＜0.05), 9月总细根生物量最大(172.82和185.68 g&#8226;m^–2), 5月总细根生物量最少(69.28和73.47 g&#8226;m^–2); 50 cm处季节变化差异不明显(p＞0.05)。细根生物量分布和季节变化不仅受土壤垂直格局影响同时也与距树干不同水平距离有很大的关系。     

外源基因转染导致小鼠体细胞过快衰老 及p16INK4a表达水平变化

对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现, 外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短; 在转染后的衰老细胞中, 或细胞随着增龄, p16^INK4a 5′-调控区DNA甲基化程度逐渐降低; 利用RT-PCR与Northern blot证明, 衰老细胞与年轻细胞中的p16^INK4a基因的表达水平存在显著差异, 传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16^INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12~16倍, 而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。     

Ribozyme抑制端粒酶活性的肿瘤基因治疗

针对端粒酶RNA组分模板区设计合成锤头状端粒酶核酶(teloRZ),构建了teloRZ基因体外转录质粒P^SPT19-teloRZ和真核表达质粒P^{XJ-neo-teloRZ}.用T₇/SP₆体外转录系统检测了teloRZ对端粒酶RNA组分的体外切割效率,达60%左右.用脂质体介导法, 将P^{XJ-neo-teloRZ}导入HeLa细胞和裸鼠移植瘤,结果使HeLa细胞端粒酶活性降至对照细胞的11%～12.5%, 细胞生长速度明显变慢,传至19～20代时出现95%凋亡.裸鼠移植瘤注射P^{XJ-neo-teloRZ} 14 d后,端粒酶活性下降69%,抑瘤率达62%.实验表明,该核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂,在肿瘤治疗中发挥作用.     

醌类光敏剂HA, HB与纳米半导体CdS间的光生电子传递——HA-CdS, HB-CdS复合体光敏还原动力学的EPR研究

根据非均相体系电子传递动力μ =E_s*/s+-E_CB(μ＜0)的原理,构建出相匹配的HA-CdS和HB-CdS复合体(以下简称Hys-CdS,Hys代表HA,HB).在该体系中,¹Hys*向CdS导带传递电子是热力学允许的.通过荧光淬灭实验,测出它们之间的表观结合常数(K_app )分别为940 (mol/L)^-1(HA-CdS),934(mol/L)^-1(HB-CdS),表明Hys与CdS间存在较强烈的吸附效应.荧光寿命测定得¹Hys*向CdS导带传递电子的速率常数K_et分别为5.16×10⁹s^-1(HA-CdS), 5.10×10⁹s^-1(HB-CdS).以一种稳定的氮氧自由基TEMPO(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperdinyloxy)作为电子受体,当它接受一个电子和一个质子,其EPR(electron paramagnetic resonance)信号便会消失,据此,应用消自旋的EPR技术,定量研究了苝醌类光敏剂Hys与纳米半导体CdS间光生电子传递动力学,确定了受Hys光敏化作用的CdS纳米半导体表面光还原速率方程和反应动力学速率常数,结果发现,本体系中TEMPO接受电子的反应级数均为0,而不同于均相体系中的反应级数,特别是在相同可见光照射条件下,通过比较单独的CdS与Hys–CdS复合体的光还原速率常数还发现,后者的光还原效率比前者均大,约为350倍,表明Hys对CdS纳米半导体具有显著的光敏化作用.这提示在太阳能应用中,Hys是一种很有效的光敏化剂.     

开垦对克氏针茅草地生态系统碳通量的影响

 植被–大气间CO₂净交换及其对环境变化的响应是目前全球变化研究的热点问题。该研究通过同化箱式法, 在内蒙古农牧交错带对比研究生长季草地生态系统和耕种多年的小麦田生态系统碳通量的变化, 以探讨该地区碳通量的变化规律及影响碳通量主要因子, 并揭示农田开垦对草原碳通量的影响。结果显示: 两个生态系统的群落净气体交换(Net ecosystem exchange, NEE)有明显的季节变化。整个测定期间, 草地生态系统的净气体交换NEE的最高值为–11.26 µmol CO₂&#8226;m^–2&#8226;s^–1, 平均群落净气体交换为–5.33 µmol CO₂&#8226;m^–2&#8226;s^–1; 小麦田群落NEE最大值为–12.29 µmol CO₂&#8226;m^–2&#8226;s^–1, 平均群落净气体交换为–7.66 µmol CO₂&#8226;m^–2&#8226;s^–1。分析发现, 叶面积指数LAI是影响该地区生态系统NEE的主要因子, 相对贫瘠的土壤也是限制该地区生态系统碳固定的一个重要因子。因小麦的生长特性, 在生长中后期, 小麦田生态系统NEE随LAI的变化没有草地生态系统的敏感。此外, 较低的土壤含水量限制了小麦田群落呼吸, 使得小麦田群落呼吸对温度的敏感性降低。     

鸡Ⅱ型胶原基因疫苗pcDNA-CCOL2A1能有效治疗大鼠类风湿性关节炎

已证明Ⅱ型胶原(CII)是类风湿性关节炎(RA)最主要的自身免疫抗原, 采用口服鸡Ⅱ型胶原蛋白(CCII)诱导免疫耐受治疗RA标志着RA治疗策略的重大进展之一. 在国际上克隆成功鸡Ⅱ型胶原蛋白基因(CCOL2A1)的基础上, 探讨了采用pcDNA-CCOL2A1基因疫苗策略治疗RA的科学性和可行性. 将克隆的CCOL2A1基因连接于真核表达载体pcDNA3.1(＋)上, 即为基因疫苗pcDNA-CCOL2A1. 然后将该表达载体pcDNA-CCOL2A1 转染COS-7细胞, 经Western blot分析显示, pcDNA-CCOL2A1在COS-7细胞中是以分泌型来表达CCII多肽链的α亚单位. 随后, 以CCII诱导的 Wistar大鼠为RA模型即CIA, 系统观察一次性尾部静脉注射20, 200, 400 μg/kg 3个不同剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗对CIA关节炎的治疗作用. 结果表明, 在注射后第5天200 μg/kg组就可观察到大鼠关节肿胀程度明显减轻, 与空载体组比较有显著性差异(P <0.05), 而20, 400 μg/kg两剂量组与空载体组比较未观察到治疗效果(P>0.05). 注射后6周, CIA大鼠血清中抗CII抗体浓度水平、TNF-α浓度在200 μg/kg治疗组较空载体组明显降低(P<0.05), 而400 μg/kg组则显著的升高, 20 μg/kg组则无明显变化. 此外, 细胞因子TGF-β, IL-10浓度水平在200 μg/kg组较空载体组明显升高(P<0.05), 而20与400 μg/kg两组则无显著性差异. 脾细胞淋巴细胞增殖实验表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗组大鼠脾细胞对CII的反应能力较空载体组明显下降(P<0.05). 此结果表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度, 降低抗CII抗体、TNF-α水平, 提高细胞因子TGF-β, IL-10水平, 降低脾细胞增殖反应能力, 对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用.     

GAP-43对Goα的激活及其构象变化基础

GAP-43和Go是富含于神经生长锥的膜外周蛋白. 用碱抽提法从牛脑皮层获得了高纯度的GAP-43, 同时在大肠杆菌表达系统中获得了高纯度的豆蔻酰化Goα. 测定GAP-43对Goa结合³⁵S-GTPγS活力影响的结果表明, GAP-43可显著促进GAP-43对Goα的GTPgS的结合活力, 且呈浓度依赖性. 用CaM-Sepharose亲和柱的实验结果表明GAP-43与GAP-43对Goα·GDP之间存在直接的相互作用. 这种相互作用所引起的Goα的构象变化的测定结果显示, GAP-43使Goα·GDP的色氨酸内源荧光发射谱谱峰蓝移4 nm, 其荧光强度增高35.3%, 并使其HB的猝灭效率明显增加, 其表观猝灭常数(Ksv)由(1.1±0.22)×10⁵增至(4.1±0.43)×10⁵ M^-1. 而GAP-43对GAP-43对Goα·GTPγS无明显影响, 表明GAP-43直接作用于GAP-43对Goα·GDP引起其构象变化, 从而加速GDP的解离和GTPγS的结合, 导致Goα的激活并启动G蛋白的循环实现信号的跨膜转导和放大. 研究结果对阐明信号转导介导分子G蛋白在偶联受体和效应器之间的作用机理提供了有力的实验证据, 对进一步深入揭示GDP和GTP的交换方式在G蛋白的循环中的关键作用提供了新的启示.     

噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计

单链阻遏蛋白R R_TRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物,含有两个DBD(DNA结合结构域),一个是野生型噬菌体434的DBD-R,另一个是突变型DBD-R_TRES,二者用重组接头以头接尾的方式连接起来.R_TRES的α-3-螺旋中-1,1,2,5位DNA结合氨基酸分别为T,R,E,S. 利用核心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的随机DNA库, 体外循环筛选R_TRES的DNA结合位点,将筛选到的群体克隆、测序.单链阻遏蛋白RR_TRES的亲和力测定表明,最适操纵区序列含有TTAC或TTCC(上述画线部分)时,K_d值在10^-12~10^-11mol/L的范围.天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的K_d值在10^-9 mol/L数量级,与之相比,所筛选操纵区的亲和力明显提高.同时发现,亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响,特别是5′位碱基的影响.根据R_TRES的识别特性,设计了共有序列为GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN (R为A或G)的单链阻遏蛋白R_TRES R_TRE的操纵区序列.结果表明,它们之间有特异性结合,且亲和力也很高.此方法可望用于其他DNA结合蛋白新的结合特异性的筛选.