影响动物细胞同源重组发生与基因打靶效率的分子机制

真核细胞的基因打靶是基因结构与功能研究的一种非常有价值的技术,也是可应用于基因治疗的具有潜力的工具。有2个限制因素束缚真核细胞基因打靶的发展,即同源重组(HR)率非常低而随机整合率非常高。通过特定基因的过表达或表达干涉,使一些参与DNA重组的蛋白表达水平瞬间改变,可能会增加HR率,降低随机整合率。本文列举了一些与HR相关的候选基因,详细介绍了其中的Rad52上位簇基因,还讨论了打靶载体的设计与修饰、DNA转染方法的有效性等。     

外源基因转染导致小鼠体细胞过快衰老 及p16INK4a表达水平变化

对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现, 外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短; 在转染后的衰老细胞中, 或细胞随着增龄, p16^INK4a 5′-调控区DNA甲基化程度逐渐降低; 利用RT-PCR与Northern blot证明, 衰老细胞与年轻细胞中的p16^INK4a基因的表达水平存在显著差异, 传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16^INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12~16倍, 而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。     

炔雌醚对雄性长爪沙鼠不育效果及其可逆性

为探讨炔雌醚对雄性长爪沙鼠生殖器官及繁殖的影响,将试鼠随机分为多剂量组、单剂量组和对照组.多剂量组以每次3.5 m/kg·BW(5次/周,2周)、单剂量组以35 mg/kg·BW炔雌醚灌胃.处理后15 d、30 d、60d、90d剖检,观察性腺系数、精子质量和繁殖率等指标,H·E染色观察附睾组织病理学变化.结果表明:与对照相比,炔雌醚处理后15 d、30 d给药组试鼠睾丸、附睾及精囊腺极度萎缩(P＜0.01),精子密度、精子活力和活精子百分率明显下降(P＜0.01),精子畸形率显著上升(P＜0.01),附睾管腔内充满大量发育异常的精子细胞,繁殖率显著下降;与单次给药相比,多次连续给药对试鼠生殖器官影响更严重.处理后60d,除多剂量组附睾外,各组性腺基本恢复至对照水平,单剂量组、多剂量组精子质量及繁殖率与对照仍有极显著差异(P＜0.01).90d后试鼠各项指标及繁殖率均恢复正常,表现为可逆性.结果表明:该药对长爪沙鼠不育效果明显;多次低剂量给药较单次高剂量给药不育效果更好;90d后,炔雌醚对生殖器官和繁殖的影响能够恢复正常.     

山羊生长激素基因5′调控区的多态性分析

以鲁北白山羊、引进波尔山羊、纯繁波尔山羊以及鲁北白山羊与波尔山羊的杂交一代、回交一代共计274个个体为研究材料,用两对引物分别扩增山羊生长激素(GH)基因5′区的26～239bp以及225～429bp片段,扩增产物经SSCP分析发现均存在多态性.在26～239bp片段上,波尔山羊及杂交后代以AA型个体占多数,而鲁北白山羊则BB型个体较多;在225～429bp片段上,所有种群均以CC型个体较多.对两个片段的纯合型(AA,BB;CC,DD)分别克隆测序发现:(1)26～239bp片段上AA型在第60位发生了C→T的突变,第211位发生碱基C的丢失,(2)225～429bp片段上,DD型存在3处突变,分别为264位由T→C,292位由T→A,372位由C→T.上述结果为首次实验证实山羊生长激素5′调控区存在序列多态性.     

体细胞核移植胚胎核重编程的研究进展

尽管在多种哺乳动物种系中成功制备了体细胞克隆后代,但当前的克隆技术仍有许多亟待解决的问题。体细胞核移植胚胎大多存在许多发育异常,造成了妊娠早期高流产率和出生后高死亡率。有研究认为,克隆胚胎发育障碍的一个重要的原因是供体细胞的遗传重编程不完全。哺乳动物种系中,DNA甲基化是胚胎发育期转录调节的必需步骤,除了单拷贝基因序列外,在基因组很多的区域都可以观测到克隆胚胎的异常甲基化。此外,克隆胚胎的基因印迹也存在异常。     

mRNA翻译起始区二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的表达及催化效率

为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率,对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1～+78区进行二级结构的优化,并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少,自由能显著下降(由原始的?9.5kcal/mol降至?5.0kcal/mol),使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4～5倍和61.9%。在高底物浓度(5.0g/L2-羟基苯乙酮)下,优化突变株不对称转化效率较高,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1%e.e.和81.8%,比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明:优化mRNA翻译起始区的二级结构,克服蛋白翻译启动的空间位阻,不仅能促进翻译的顺利进行,使目标蛋白得到高效表达,而且有利于蛋白空间结构的正确折叠,有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。     

不同二氧化碳浓度培养对两株栅藻碳固定速率及油脂积累的影响

正人类在利用化石燃料的过程中会导致大量有害温室气体CO_2的排放,促进全球气候变暖。微藻可通过光合作用固定CO_2,同时大量的微藻生物质还能作为生物能源的原料[1],因此,越来越多的研究关注于微藻生物固碳以达到降低碳排放的目的。利用微藻光合作用进行CO_2固定是一种能量节约型和环境友好型技术手段[2]。在利用微藻进行CO_2生物固定以及生物燃料生产时,研究微藻的CO_2固定能力、CO_2对微藻的生长以及油脂积累的影响等都是十分重要的。国内外利用微藻进行生     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用 DIG 末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异（P<0.01）,平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

中国大陆地区发现一例罕见的血小板抗原HPA-10bW等位基因报告

采用序列特异性引物-聚合酶链式反应(PCR-SSP)为基础的人类血小板抗原(HPA)基因分型技术做群体调查, 在1,000例受检者中发现1例罕见的HPA-10w(a+b+)杂合子个体, 为了验证分型的可靠性, 使用PCR反应特异性扩增HPA-10基因片段, 然后测序分析。结果表明, nt263位G→A导致GPⅢa糖蛋白第62位精氨酸(CGA)→谷氨酰胺(CAA), 产生HPA-10bw抗原特异性。在中国人群中检测出HPA-10bw低频抗原, 提示在血小板同种免疫引起的新生儿同种免疫血小板减少症(NAIT)、输血后紫癜症(PTP)以及血小板输注无效症(PTR)的诊断中, 该抗原具有临床意义。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。