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构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1~4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1~4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。 相似文献
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来源于线虫Caenorhabditis briggssae 的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析 总被引:3,自引:0,他引:3
ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。 相似文献
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对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现, 外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短; 在转染后的衰老细胞中, 或细胞随着增龄, p16INK4a 5′-调控区DNA甲基化程度逐渐降低; 利用RT-PCR与Northern blot证明, 衰老细胞与年轻细胞中的p16INK4a基因的表达水平存在显著差异, 传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12~16倍, 而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。 相似文献
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目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达. 相似文献
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基因打靶方法制备乳腺生物反应器 总被引:4,自引:0,他引:4
基因打靶技术制备乳腺生物反应器,克服了显微注射法的众多缺陷,并随着第一例基因打靶家畜的诞生而成为这一研究领域的热点。本文从制备乳腺生物反应器过程中基因打靶策略、打靶细胞到打靶位点的选择等各个方面,详细分析了其中的技术难点、解决问题的对策、国内外研究进展以及应用前景。 相似文献
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以人胎肝为材料,通过PT-PCR的方法扩增出人促红细胞生成素受体(hPeoR)的胞外区基因。将获得的或熟体胞外区基因起始密码子改构后克隆原核表达载体pBV220中,进行原核温控诱导表达。表达产物经蛋白N端测序及Western-blot实验证实表达产物是hEpoR胞外区蛋白。利用上罐发酵培养获得的包涵体蛋白经复性纯化后,体外生物学活性检测表明表达产物可特 抑制TF-1细胞在Epo刺激下的生长,证实了 相似文献
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转基因在受精卵中的整合时间对于转基因动物的建立十分重要。采用WAP基因调控序列指导的人G-CSF基因为构件,对小鼠受精卵进行显微注射。对培养至1细胞期、2细胞期和8细胞期的胚胎进行PCR检测。结果表明,三个时期转基因的检出率分别为100%、77.77%和44.44%。说明随着培养时间的增加,转基因逐渐丢失。 相似文献