鼠伤寒沙门氏菌PurR阻遏蛋白Trp-147, Gln-218和Gln-292氨基酸残基的功能分析

对从purR超阻遏突变体(purR^s)出发分离的purR(am)突变体进行了purR编码区DNA片段的克隆和测序,确定了6个purR(am)突变体的am突变位点,其中3个位于C⁹³³(Gln-218),2个位于G⁷²¹(Trp-147),1个位于C¹¹⁵⁵(Gln-292).进而对位于PurR辅阻遏物结合区的这3个不同am位点,通过引入tRNA抑制基因(sup),进行了5种不同氨基酸取代,并测定了对PurR阻遏蛋白功能的影响.结果显示,Cys,Glu,Gly,His和Arg5种氨基酸分别取代Trp-147,都不能明显恢复purR阻遏蛋白的调节功能,证实了Trp-147是影响PurR调节功能的重要氨基酸残基.Cys等5种氨基酸对Gln-292的取代也不能恢复PurR阻遏蛋白的调节功能,证明了Gln-292也是影响PurR阻遏蛋白调节功能的重要氨基酸.     

醌类光敏剂HA, HB与纳米半导体CdS间的光生电子传递——HA-CdS, HB-CdS复合体光敏还原动力学的EPR研究

根据非均相体系电子传递动力μ =E_s*/s+-E_CB(μ＜0)的原理,构建出相匹配的HA-CdS和HB-CdS复合体(以下简称Hys-CdS,Hys代表HA,HB).在该体系中,¹Hys*向CdS导带传递电子是热力学允许的.通过荧光淬灭实验,测出它们之间的表观结合常数(K_app )分别为940 (mol/L)^-1(HA-CdS),934(mol/L)^-1(HB-CdS),表明Hys与CdS间存在较强烈的吸附效应.荧光寿命测定得¹Hys*向CdS导带传递电子的速率常数K_et分别为5.16×10⁹s^-1(HA-CdS), 5.10×10⁹s^-1(HB-CdS).以一种稳定的氮氧自由基TEMPO(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperdinyloxy)作为电子受体,当它接受一个电子和一个质子,其EPR(electron paramagnetic resonance)信号便会消失,据此,应用消自旋的EPR技术,定量研究了苝醌类光敏剂Hys与纳米半导体CdS间光生电子传递动力学,确定了受Hys光敏化作用的CdS纳米半导体表面光还原速率方程和反应动力学速率常数,结果发现,本体系中TEMPO接受电子的反应级数均为0,而不同于均相体系中的反应级数,特别是在相同可见光照射条件下,通过比较单独的CdS与Hys–CdS复合体的光还原速率常数还发现,后者的光还原效率比前者均大,约为350倍,表明Hys对CdS纳米半导体具有显著的光敏化作用.这提示在太阳能应用中,Hys是一种很有效的光敏化剂.     

氯化钠胁迫对不同品种南瓜幼苗阳离子含量的影响

选择19个不同类型南瓜品种,研究了300 mmol·L^-1 NaCl胁迫条件下,幼苗地上部和根系Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量、Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、钠-钾和钠-钙运输选择性系数(S_Na⁺,K⁺和S_Na⁺,Ca²⁺值)的变化.结果表明：NaCl胁迫处理8 d后,不同品种南瓜幼苗Na⁺含量均明显增加,而K⁺含量下降,离子平衡被打破.青栗（Q₁）南瓜幼苗根系Na⁺含量、地上部Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、S_Na⁺,K⁺和S_Na⁺,Ca²⁺值均明显高于黑蜜南瓜（H₂）和黑籽南瓜（H₃）.不同品种南瓜幼苗体内Na⁺含量、地上部Na⁺/K⁺和Na⁺/Ca²⁺、S_Na⁺,K⁺和S_Na⁺,Ca²⁺值变化趋势与NaCI胁迫下不同品种南瓜幼苗盐害指数的结果基本一致,进一步验证了Q₁耐盐性强与NaCl胁迫下地上部Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、S_Na⁺,K⁺和S_Na⁺,Ca²⁺值较低以及K⁺、Ca²⁺含量较高有关;而H₂和H₃对盐敏感与NaCl胁迫下地上部Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、S_Na⁺,K⁺和S_Na⁺,Ca²⁺值较高,以及K⁺、Ca²⁺含量较低有关.     

抗CD5单链抗体基因克隆和表达

以分泌抗CD5单克隆抗体的杂交瘤细胞poly(A) mRNA为模板,通过RTPCR扩增出抗CD5单克隆抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL) cDNA片段组装出抗CD5单链抗体(ScFv) cDNA片段。该ScFv片段被克隆到pCANTAB 5E载体上,以E.coli TG1为宿主,进行噬菌体表面呈现。通过Molt4细胞表面分子CD抗原,对噬菌体表面呈现的ScFv进行免疫亲和富集筛选。经细胞ELISA鉴定,得到4株高亲和力克隆。DNA序列分析得知,单链抗体全长732碱基,其中VH为339碱基,VL为300碱基。抗CD5 ScFv在E.coli HB2151中以可溶形式分泌表达,产物主要分布于周质之中,占周质中总蛋白的20%。     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21(Aspergillus niger T21)的糖化酶基因(glaA)5′cis调控区片段为探针, 采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5′调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5′调控区的-374~ -344,-484~-414以及-580~-540 bp 3个区段, 且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争, 表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合. 以-374~-344 bp序列为探针的紫外交联实验表明, 该蛋白因子的分子量(或亚基分子量)约为10 ku. 利用DNaseⅠ足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位, 并对其结合序列的特性进行了分析.     

A comparison of nitrate transport in four different rice (Oryza sativa L.) cultivars

As rice can use both nitrate (NO₃^-) and ammonium (NH₄⁺), we have tested the hypothesis that the shift in the pattern of cultivars grown in Jiangsu Province reflects the ability of the plants to exploit NO₃^- as a nitrogen (N) source. Four rice cultivars were grown in solution culture for comparison of their growth on NO₃^- and NH₄⁺ nitrogen sources. All four types of rice, Xian You 63 (XY63), Yang Dao 6 (YD), Nong Keng 57 (NK) and Si You 917 (SY917), grew well and produced similar amounts of shoot biomass with 1 mmol/L NH₄⁺ as the only N source. However, the roots of NK were significantly smaller in comparison with the other cultivars. When supplied with 1 mmol/L NO₃^-, YD produced the greatest biomass; while NK achieved the lowest growth among the four cultivars. Electrophysiological measurements on root rhizodermal cells showed that the NO₃^--elicited changes in membrane potential (ΔE_m) of these four rice cultivars were significantly different when exposed to low external NO₃^- (<1 mmol/L); while they were very similar at high external NO₃^- (10 mmol/L). The root cell membrane potentials of YD and XY63 were more responsive to low external NO₃^- than those of NK and SY917. The ΔE_m values for YD and XY63 rhizodermal cells were almost the same at both 0.1 mmol/L and 1 mmol/L NO₃^-; while for the NK and SY917 the values became larger as the external NO₃^- increased. For YD cultivar, ΔE_m was measured over a range of NO₃^- concentrations and a Michaelis-Menten fit to the data gave a K_m value of 0.17 mmol/L. Net NO₃^- uptake depletion kinetics were also compared and for some cultivars (YD and XY63) a single-phase uptake system with first order kinetics best fitted the data; while other cultivars (ND and SY917) showed a better fit to two uptake systems. These uptake systems had two affinity ranges: one had a similar K_m in all the cultivars (0.2 mmol/L); the other much higher affinity system (0.03 mmol/L) was only present in NK and SY917. The expression pattern of twelve different NO₃^- transporter genes was tested using specific primers, but only OsNRT1.1 and OsNRT2.1 expression could be detected showing significant differences between the four rice cultivars. The results from both the physiological and molecular experiments do provide some support for the hypothesis that the more popular rice cultivars grown in Jiangsu Province may be better at using NO₃^- as an N source.     

芝田硫化叶菌Ssh7蛋白的进化保守性及DNA结合特性

嗜酸热古菌——芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)合成大量7 kD DNA结合蛋白Ssh7. Southern杂交结果显示, 该菌基因组中含有两个编码Ssh7蛋白的基因, 分别命名为ssh7a和ssh7b. 对这两个基因进行了克隆、序列测定和在大肠杆菌中的表达. 测序结果表明, 两个Ssh7多肽仅在3个氨基酸位置上有差异; 此外, ssh7a和ssh7b的顺式调控序列也十分相似, 提示存在着维持两个基因的序列和表达都不变的选择压力. 杂交结果还显示, 与芝田硫化叶菌一样, 硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)基因组中也含有两个编码7 kD蛋白的基因. 结合其他报道, 这一结果提示编码7 kD蛋白的基因可能在硫化叶菌种间分歧形成之前发生了基因复制. 采用电泳迁移率改变试验(EMSA)分析了天然及重组Ssh7蛋白与双链DNA片段之间的相互作用. 天然和重组蛋白的EMSA行为相似, 说明Ssh7与DNA的相互作用既不受发生在天然蛋白赖氨酸残基上的甲基化的影响, 也不受两种多肽异构体之间在序列上的差异的影响. 在所采用的实验条件下, Ssh7与双链DNA片段结合时的结合位点大约为6.6 bp, 表观解离常数为(0.7~1.0)×10^-7 mol/L. 此外, Ssh7与负超螺旋DNA的结合强于与线性和松弛DNA的结合.     

snthr-1Bao稀毛小鼠突变基因的精确定位及克隆鉴定

snthr^-1Bao稀毛小鼠是本实验室培育的呈单基因隐性遗传的突变系小鼠,突变基因已被初步定位于第9号染色体末端;为了精确定位并鉴定snthr^-1Bao稀毛小鼠的突变基因,将(C57BL/6J×snthr^-1Bao)F₁代互交繁殖F₂代小鼠4 400余只,其中稀毛小鼠1 100只,并在2个微卫星、35个可能的简单序列重复标记（simple sequence repeat,SSR）及3个酶切扩增多态性序列（c1eaved amplified polymorphic sequences,CAPS）标记中找到4个合适的基因组标记。利用这些标记及F₂代稀毛小鼠将突变基因精确定位到第9号染色体距着丝粒117.763 kb及119.129 kb之间1.367 Mb的范围内,在其间的21个基因中确定Plcd1为稀毛突变的强力候选基因。通过对基因组的直接测序,发现snthr^-1Bao稀毛小鼠基因组上有一个14 883 bp的缺失,这一缺失包含了Plcd1基因的4—15号外显子及Vill基因的10—19号外显子。推测极可能是Plcd1基因缺失导致snthr^-1Bao小鼠出现稀毛表型。     

西双版纳热带季节雨林优势树种树干呼吸特征

 采用红外气体分析法（IRGA）原位监测了西双版纳热带季节雨林11种优势树种树干呼吸速率、1 cm深树干温度以及林内空气变化情况。研究发 现,11种优势树种的树干呼吸具有相同的季节规律,并且雨季均大于干季时的树干呼吸。树种间树干呼吸速率差异显著,在0. 823～2.727 μmol&;#8226;m^-2&;#8226;s^-1。树干1.3 m处所测南北方向树干呼吸无显著性差异。树干呼吸与树干温度显著相关(0.552<0.92),呈良好的自然指数回归关 系,Q₁₀值为1.90～3.03。20 ℃时各树种的RT（总树干呼吸）速率为0.771～2.570μmol&;#8226;m^-2&;#8226;s^-1。     

甘草次酸与AT1受体结合的研究

运用受体放射配基结合法, 激光共聚焦显微镜技术, Northern blot, ³H-TdR掺入DNA等技术, 研究甘草次酸(glycyrrhetic acid, GA)与AT₁受体的结合以及此作用的可能机制. 研究表明, GA对血管平滑肌细胞(VSMC) AT₁受体有较好的结合作用(IC₅₀为35.0 μmol/L), 它能引起细胞内[Ca²⁺]_i增加, 激活转录因子c-myc, 从而产生对VSMC的增殖作用, 因此, GA具有AT₁受体激动剂样作用, 这一结果为中药甘草的药理作用提供一种新机制.     

千烟洲红壤丘陵区人工针叶林土壤CH4排放通量

 CH₄在温室效应中起着重要作用,为估算中亚热带CH₄的源汇现状,评价森林生态系统对温室效应的影响,采用静态箱-气相色谱法研究了千烟洲红壤丘陵区人工针叶林的土壤CH₄ 排放通量特征及水热因子对其的影响。对2004年9月～2005年12月期间的观测结果分析表明 ：千烟洲人工针叶林土壤总体表现为大气CH₄的吸收汇,原状林地土壤(Forest soil)情况下,CH₄通量的变化为7.67～-67.17μg&;#8226;m^-2&;#8226;h^-1,平均为-15.53μg&;#8226;m^-2&;#8226;h^-1;无凋落物处理(Litter-free)情况下,CH₄通量的变化是9.31～-90.36 μg&;#8226;m^-2&;#8226;h^-1,平均为-16.53μg&;#8226;m^-2&;#8226;h^-1。 二者对土壤CH₄的吸收表现出明显的季节变化规律,秋>夏>冬>春,但无凋落物处理CH₄变化幅度较原状林地土壤大,无凋落物处理吸收高峰出现在10月,最低值出现在翌年3月,原状林地土壤则分别在9月和翌年2月,均提前1个月。对土壤CH₄吸收通量与温度和湿度的相关分析表明： 无论是原状林地土壤还是无凋落物处理情况下,土壤CH₄通量都与地下5 cm的温度和湿度相关性最高。偏相关分析反映了不同季节水热配置对土壤吸收CH₄通量的影响：冬季为12月～翌年2月,温度起主要作用;雨季3～6月,温度作用为主,随着温度的升高而升高,水分作用微弱;7～8月,CH₄吸收通量随着湿度的降低而增加,但高温限制了CH₄的吸收;秋季（9～11月）水热配置适宜,CH₄通量达到高峰值。总之,CH₄吸收通量随着温度的升高和 湿度的降低而增大,但温度过高会抑制其吸收。     

三江平原草甸湿地土壤呼吸和枯落物分解的CO2释放

利用静态箱-碱液吸收法研究了三江平原草甸湿地土壤呼吸和枯落物分解的CO₂释放速率,讨论了影响CO₂释放的环境因素,估算了枯落物分解的CO₂释放对于总释放的贡献。结果表明,生长季,小叶章沼泽化草甸和小叶章湿草甸各部分CO₂释放均具有明显的时间变化特征,温度和水分是重要制约因素。两类草甸湿地的平均土壤呼吸速率分别为4.33g•m^-2•d^-1和6.15g•m^-2•d^-1,枯落物分解的CO₂平均释放速率分别为1.76g•m^-2•d^-1和3.10g•m^-2•d^-1,枯落物分解的CO₂释放占总释放量的31%和35%,说明在碳素由地上植物碳库转移到地下土壤碳库的过程中,湿地枯落物是一个不可忽略的碳损失源。     

Cloning and sequencing of nifBHDKENX genes of Paenibacillus massiliensis T7 and its nif promoter analysis

A 324 bp of nifH fragment was PCR amplified from Paenibacillus massiliensis T7 using the universal degenerate primers. The PCR-amplified nifH fragment was labeled with DIG and then used as a probe in Southern blot analysis. Southern blot result showed that there were two positive signals, indicating that there might be two copies of nifH in P. massiliensis T7. A total of 10254 bp DNA sequence containing purD and nifBHDKENX was obtained by five rounds of inverse-PCR amplification. The predicted proteins of nifBHDKENX had high homology with those from other nitrogen-fixing bacteria. Only one putative σ⁵⁴-dependent promoter sequence was detected upstream of the nifB gene and nifBHDKENX were likely to be organized in one operon. Assays of β-galactosidase activity of P. massiliensis T7PB carrying a nifB-lacZ fusion under different concentrations of NH⁺₄ and O₂ showed that the expression of nifB-lacZ was strongly inhibited by O₂.     

排放通量

CH₄在温室效应中起着重要作用,为估算中亚热带CH₄的源汇现状,评价森林生态系统对温室效应的影响,采用静态箱-气相色谱法研究了千烟洲红壤丘陵区人工针叶林的土壤CH₄ 排放通量特征及水热因子对其的影响。对2004年9月～2005年12月期间的观测结果分析表明 ：千烟洲人工针叶林土壤总体表现为大气CH₄的吸收汇,原状林地土壤(Forest soil)情况下,CH₄通量的变化为7.67～-67.17μg&#8226;m^-2&#8226;h^-1,平均为-15.53μg&#8226;m^-2&#8226;h^-1;无凋落物处理(Litter-free)情况下,CH₄通量的变化是9.31～-90.36 μg&#8226;m^-2&#8226;h^-1,平均为-16.53μg&#8226;m^-2&#8226;h^-1。 二者对土壤CH₄的吸收表现出明显的季节变化规律,秋>夏>冬>春,但无凋落物处理CH₄变化幅度较原状林地土壤大,无凋落物处理吸收高峰出现在10月,最低值出现在翌年3月,原状林地土壤则分别在9月和翌年2月,均提前1个月。对土壤CH₄吸收通量与温度和湿度的相关分析表明： 无论是原状林地土壤还是无凋落物处理情况下,土壤CH₄通量都与地下5 cm的温度和湿度相关性最高。偏相关分析反映了不同季节水热配置对土壤吸收CH₄通量的影响：冬季为12月～翌年2月,温度起主要作用;雨季3～6月,温度作用为主,随着温度的升高而升高,水分作用微弱;7～8月,CH₄吸收通量随着湿度的降低而增加,但高温限制了CH₄的吸收;秋季（9～11月）水热配置适宜,CH₄通量达到高峰值。总之,CH₄吸收通量随着温度的升高和 湿度的降低而增大,但温度过高会抑制其吸收。     

施氮水平对水稻生育后期地上部氨挥发的影响

采用温室盆栽模拟试验,研究了不同施氮水平下水稻开花后地上部氨挥发及其影响因素.结果表明：不同品种水稻开花后地上部日氨挥发量和开花至成熟期的氨挥发总量均随施氮量的增加而增加,且不同施氮水平间存在一定差异.花期和成熟期水稻地上部氨挥发量（y）与功能叶片谷氨酰胺合成酶（GS）活性（x₁）呈显著负相关,而与功能叶片质外体NH₄⁺浓度（x₂）呈显著正相关:y=-0.37846x₁+0.41821x₂+0.04925（R²=0.9471,n=16）.水稻氮素收获指数（x₁）和氮肥生理利用率（x₂）均与地上部氨挥发总量（y）呈显著负相关：y=-0.02117x₁+0.75186(R²=0.8426,n=8）和y=-1.10386x²+35.52676（R²=0.8489,n=8）,说明高氮水平下水稻氮肥利用率的下降与水稻地上部氨挥发量的增加有关.     

热带季节雨林优势树种叶片和冠层尺度二氧化碳交换特征

采用叶室法和涡度相关法分析了西双版纳热带季节雨林优势树种绒毛番龙眼和大叶白颜树冠层及其叶片在不同季节的CO₂交换量,并拟合得到主要特征值.结果表明：以叶室法测得的两树种冠层最大净光合速率(P_{max A})为雨季>雨季末>雾凉季>干热季,叶片暗呼吸速率(R_d)为雨季>雨季末>干热季>雾凉季;以涡度相关法得到的两树种冠层最大净光合速率(P_{max B})为雨季>雨季末>雾凉季>干热季,而冠层呼吸速率(R_e)则是雨季>干热季>雾凉季>雨季末.两种方法得到的不同季节植物冠层最大净光合速率相差0.9～2.0 μmol·m^-2·s^-1.     

抗SARS 人源单链抗体H12的表达及复性

从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARS-CoV人源单链抗体H12,亟待鉴定。为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28a-H12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上。采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性与纯化,结果显示两种方法都能使得单链抗体复性。与稀释复性法相比,柱复性效果更好,其抗原结合活性是稀释复性法的1.51倍。柱复性后的单链抗体亲和力测定的解离常数K_d为73.5nmol/mL。为进一步研究单链抗体H12的功能奠定了基础。     

亚热带杉木和马尾松群落土壤系统呼吸及其影响因子

 亚热带杉木(Cunninghamia lanceolata)和马尾松(Pinus massoniana)在我国森林资源中占有十分重要的地位, 研究它们的土壤与表层凋落物的呼吸有助于了解它们的碳源汇时空分布格局及碳循环过程的关键驱动因子。采用Li-Cor 6400-09连接到Li-6400便携式CO2/H2O分析系统测定湖南两种针叶林群落(2007年1月至12月)的土壤呼吸及其相关根生物量和土壤水热因子。研究结果表明: 杉木和马尾松群落中土壤呼吸的季节变化显著, 在季节动态上的趋势相似, 都呈不规则曲线格局, 全年土壤呼吸速率平均值分别为186.9 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1和242.4 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1。从1月开始, 两种群落的土壤呼吸速率由最小值33.9 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1和38.6 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1随着气温的升高而升高, 杉木群落到7月底达到全年中最大值326.3 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1, 而马尾松群落到8月中旬达到最大值467.3 mg CO₂&#8226;m^–2&#8226;h^–1, 土壤呼吸的季节变化与土壤温度呈显著的指数相关, 土壤温度可以分别解释土壤呼吸变化的91.7%和78.0%, 和土壤含水量呈二次方程关系, 土壤含水量可以解释土壤呼吸变化的5.4%和8.4%。由土壤呼吸与土壤温度拟合的指数方程计算Q₁₀值, 杉木和马尾松群落中全年土壤呼吸的Q₁₀值分别为2.26和2.13, Q₁₀值随着温度升高逐渐减小。两种群落土壤呼吸的差异主要受群落植被的根生物量、群落的凋落物量的影响。     

三江平原典型小叶章湿地土壤硝化反硝化作用与氧化亚氮排放

应用C₂H₂抑制原状土柱培育法研究了三江平原典型小叶章湿地土壤N₂O排放速率及反硝化速率的变化,分析了它们与环境因子的关系,并估算了N₂O排放量及反硝化损失量.结果表明：草甸沼泽土和腐殖质沼泽土N₂O排放速率的变化基本一致,其范围分别为0.020～0.089 kg N·hm^-2·d^-1和0.012～0.033 kg N·hm^-2·d^-1,前者的N₂O排放速率均明显高于后者(平均为1.79±1.07倍),且其差异达到显著水平(P＜0.05);二者反硝化速率的变化并不一致,其范围分别为0.024～0.127 kg N·hm^-2·d^-1和0.021～0.043 kg N·hm^-2·d^-1,前者的反硝化速率一般也要高于后者(平均为1.67±1.56倍),但其差异并未达到显著水平(P＞0.05);硝化作用在前者N₂O排放和氮素损失过程中发挥了重要作用,而反硝化作用则是导致后者N₂O排放和氮素损失的重要过程;氮素物质基础不是影响二者硝化-反硝化作用的重要因素;温度对前者硝化 反硝化作用的影响比后者更为明显,其反硝化速率与5、10和15 cm地温均呈显著正相关(P＜0.05);二者所处湿地水分条件的差异是导致其N₂O排放速率及反硝化速率差异的重要原因.生长季内,前者的N₂O排放量和反硝化损失量分别为5.216 kg N·hm^-2和6.166 kg N·hm^-2,而后者分别为3.196 kg N·hm^-2和4.407 kg N·hm^-2;在二者的反硝化产物中,N₂O/N₂的比率最高,分别为5.49和3.76,表明N₂在后者反硝化产物中所占的比例明显高于前者,说明季节积水条件会导致N₂O/N₂比例降低.     

丙型肝炎病毒 NS3 螺旋酶寡核苷酸 适配子的筛选与鉴定

为筛选和鉴定抗丙型肝炎病毒 (HCV) NS3 螺旋酶 (NS3h) 的寡核苷酸适配子 (aptamers). 利用 SELEX 技术,以 HCV NS3h 为靶分子,从体外合成的 81 bp 随机单链 DNA 文库中筛选与 HCV NS3h 特异结合的寡核苷酸适配子 . 克隆测序后,进行了解离常数 (K_d) 测定和 Clustal W 软件包分析适配子一级结构 . 经过 8 轮循环筛选,随机 ssDNA 库与 HCV NS3h 的结合率从 0.45% 上升到 29.5%. 所有的一级结构没有共同的同源序列,但可分 5 个家族,其中 4 个家族具有共同的保守序列 . 解离常数测定表明,寡核苷酸适配子 H2 与 HCV NS3h 特异结合的亲和力最高,K_d值为 140 nmol/L. 适配子 H2 (10 μmol/L) 在体外对 HCV NS3h 的活性具有一定的抑制作用,抑制率达 44%. 利用随机寡核苷酸文库获得了抗 HCV NS3h 的寡核苷酸适配子 .