人血红素加氧酶同工酶的分离纯化初报

首次报道了人肝脏血红素加氧酶的同工酶的分离纯化,并初步探讨了它们的性质,采用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５和羟基磷灰石柱层析法从人肝脏分离纯化ＨＯ的同工酶,酶活性检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果显示,人肝脏微粒体含量ＨＯ的同工酶,按洗脱先后顺序分别得到分子量为３００００和３６０００的ＨＯ－１和ＨＯ－２．酶促反应中需相同辅酶参与,其中酶活性ＨＯ－１明显高于ＨＯ－２,两之比为２．４：１,从分子量和     

大鼠肝及脑组织中微粒体血红素加氧酶同工酶研究

采用离子交换层析和免疫印迹法分离、纯化和分析血红素和苯肼诱导后大鼠肝脏、脑组织.结果显示：纯化诱导后的大鼠肝脏,获得 HO-1和 HO-2,前者活性高于后者为2∶1.未诱导的大鼠肝脏仅获得HO-2,但诱导剂作用后,HO-1活性明显增加,而HO-2未见改变.HO-1和HO-2表观分子质量分别为30 ku和36 ku.诱导剂未作用的肝脏及作用的脑层析后仅获得HO-2活性的洗脱峰.免疫印迹法检测发现大鼠肝脏HO-2抗体与脑HO-2间有交叉反应,与肝脏HO-1无反应.实验表明在诱导剂作用的大鼠肝脏内含HO-1和HO-2同工酶,其中HO-1为诱导型酶.诱导剂作用的脑仅含HO-2.两种构型在表观分子质量,诱导性和免疫化学特性方面明显不同.     

大鼠HO-1表达质粒构建、活力检测及抗HUVEC凋亡的作用研究

异种移植排斥反应的主要特征为内皮细胞发生Ⅱ型激活,引起黏附分子、细胞因子和前促凝分子等基因高表达,造成血管收缩、白细胞黏附、激活、聚集和血栓形成,最终导致内皮细胞凋亡。保护基因HO-1通过抑制前炎症反应及免疫调抑作用以保护异种移植器官。因此,通过构建含剪切的野生型大鼠HO-1 cDNA的表达型质粒,用DOTAP包裹转入HUVEC中表达,测定表达量及表达产物活性;采用TNF-α诱导细胞凋亡,以及Heme和SnPP分别刺激细胞,诱导和抑制细胞内HO-1表达量,流式细胞仪测定细胞凋亡率,明确HO-1的抗细胞凋亡作用。结果显示HO-1在HUVEC中高度表达,活力为对照组5倍;TNF-α诱导细胞凋亡,但Heme处理后细胞凋亡率下降至20%以下,而SnPP处理后细胞凋亡率显著上升,最高达到95%以上,并且HO-1基因表达抑制时细胞凋亡率是诱导时的5-20倍。本实验表明Heme处理后HO-1表达上调,具有显著抗细胞凋亡作用,细胞凋亡率与HO-1表达量呈负相关,提示HO-1通过抑制细胞凋亡,对细胞有保护作用。     

血红素加氧酶-1、树突状细胞和调节性T细胞在慢性气道炎症中的作用及相互关系

慢性气道炎症是多种肺部疾病的共同病理生理过程,是由多种炎症细胞、炎症介质及细胞因子相互作用所致的气道病变。血红素加氧酶(HO)-1、树突状细胞(DC)和调节性T细胞(Treg)参与了气道炎症并发挥不同的作用,表现在HO-1具有抗炎抗氧化及保护细胞的作用;DC除可导致或持续气道炎症反应外,也具有负向调控作用,可诱导免疫耐受而抑制炎症的发展;而Treg可发挥免疫调抑功能,以此维持免疫稳态及抑制气道炎症。HO-1、DC和Treg相互作用,影响着气道炎症的发生发展。现对三者在气道炎症中的作用及相互关系进行综述。     

用siRNA沉默人血红素加氧酶-1基因降低胆红素水平

拟通过RNA干扰技术特异下调人血红素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)基因的表达,减少hHO-1的产量从而降低胆红素的产生,探讨在胆红素产生前就阻断其产生,为临床早期防治新生儿高胆红素血症及胆红素中毒性脑病探索一种新的有效手段。针对hHO-1基因设计并化学合成三对小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。采用脂质体转染法将siRNA转染入人肝脏细胞株HL-7702;荧光显微镜检测siRNA转染细胞的效率;转染siRNA1~2天后经RT-PCR和Western印迹方法检测hHO-1表达水平和蛋白质量;并采用HO-1诱导剂血红素诱导或hHO-1表达质粒转染细胞以上调hHO-1表达,检测siRNA干扰后hHO-1产量和酶活性。结果显示:设计的三对siRNA能不同程度的特异下调hHO-1表达,筛选获得抑制效果最佳的siRNA-3。siRNA-3抑制hHO-1呈现浓度与时间依赖性。与非特异对照siRNA及未处理组比较,血红素诱导和hHO-1表达质粒转染均能上调HL-7702细胞内hHO-1表达,提高hHO-1产量,但转染siRNA-3后hHO-1表达明显抑制,同时hHO-1活性随着基因表达下调而下降。实验表明设计合成的siRNA-3抑制效果明显。siRNA-3通过降解hHO-1,减少hHO-1产量,降低酶活性,最终减少胆红素产生,从而使RNA干扰技术成为降低新生儿高胆红素血症和胆红素中毒性脑病发生的一种候选方法。     

hHO-1结构预测及突变体的构建、表达、纯化和活性测

人血红素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)是血红素代谢的限速酶,直接调节体内胆红素水平.利用软件Spdbv程序对hHO-1进行结构模拟预测,以Ala取代第25位His残基,hHO-1活性部位的结构有较明显的改变,但据模拟推测突变后hHO-1与血红素仍然具有结合性.依据模拟结果,构建野生型和突变体表达载体pBHO-1和pBHO-1(M),并分别转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经30%-60%(NH4)2SO4盐析后纯度提高3.6倍,再经两次Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂分离则表达产物的纯度提高30倍.酶活性测定显示,突变体hHO-1(△hHO-1)较野生型hHO-1(whHO-1)活性下降了91.21%.本研究显示hHO-1的第25位His在酶与底物血红素氧化反应中起着重要作用,为有效调控酶活性发挥其生物学作用提供依据.     

血红素加氧酶同工酶的结构与功能

血红素加氧酶(Hemeoxygenase,HO)是一种膜结合蛋白,哺乳动物体内共发现3种同工酶,HO 1、HO 2和HO 3.HO能催化血红素降解生成α 胆绿素,铁离子和CO.这些产物都有着重要的生理作用.对HO的结构和功能研究有助于人们正确认识其催化机理和生理意义.因此从HO的催化作用、HO同工酶、HO同工酶的活性部位及HO催化的区域选择性方面作一综述.     

血红素加氧酶-1可能经诱导 foxp3+CD4 +CD25 + Treg细胞抑制哮喘气道炎症

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)作为体内保护蛋白, 在哮喘气道炎症中具有显著的抗炎作用. foxp3+CD4 ⁺CD25 ⁺ T调节细胞(T regulatory cells, Treg)是调节性细胞的主要组成部分, 以抑制的方式调控其他效应细胞的活性和功能. IL-10是多种细胞分泌的抗炎细胞因子, 具有免疫抑制功能. 本研究探讨HO-1诱导foxp3 ⁺CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 增加IL-10分泌以拮抗哮喘气道炎症. 选用磁珠分离CD4⁺CD25⁺ Treg, 含 HO-1 质粒转染或血红素(Hemin)和锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin, SnPP)处理, RT-PCR和Western blot方法检测显示Hemin上调HO-1表达, CD4⁺CD25⁺ Tregfoxp3 表达及蛋白水平显著增加, ELISA方法测定上清液IL-10水平明显升高. 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏、激发的哮喘小鼠, Hemin上调HO-1表达, 肺和脾脏中foxp3表达及蛋白量亦增加, 血清IL-10增高, 而OVA特异性IgE水平降低. 肺病理组织学检测、支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid, BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)计数均显示炎性细胞尤其是EOS浸润减少; CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg功能抑制实验发现, OVA致敏、激发Balb/C小鼠经Hemin干预后, 抑制作用显著增加; SnPP能逆转HO-1作用. IL-10剔除的B6.129P2-Il10^tm1Cgn/J小鼠Treg抑制作用经Hemin干预后仍未改善. 但体内外实验发现TGF-β水平无变化. 本研究表明: HO-1可能经诱导CD4 ⁺CD25⁺ Treg 特异性转录因子foxp3表达, 激活CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 促进IL-10分泌, 以拮抗哮喘气道炎症.     

人体血红素加氧酶-1的研究进展

血红素加氧酶（heme oxygenase,HO)是哺乳动物中血红素代谢的限速酶,HO－1是HO同功酶之一,主要分布在肝、脾、肺等多种脏器,具有调节和保护功能。作者拟从人体HO－1蛋白的晶体结构、HO－1的功能和HO－1表达的诱导因素,以及HO－1基因的表达与调控等研究进展做一综述。