CTLA4Ig-IRES-OX40Ig重组腺病毒的构建及其生物学特性

利用基因重组技术,拼接目的基因CTLA4Ig-IRES-OX40Ig,并亚克隆入腺病毒载体pTrack-CMV中,构建pT/CTLA4Ig-IRES-OX40Ig载体,与pAdeasy-1共同转染BJ5183以进行同源重组,所获得的重组子用LipofectAMINE2000转染293A细胞包装病毒,获得了可同时分别表达CTLA4Ig和OX40Ig的重组腺病毒AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig,并进行扩增和滴度测定,用Western印迹鉴定293A细胞培养上清中目的基因的表达,用混合淋巴细胞反应研究其免疫抑制活性.利用上述方法成功构建了穿梭质粒pT/CTLA4Ig-IRES-OX40Ig;并且获得了重组腺病毒AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig,在感染的293A细胞的培养上清中可以同时检测到CTLA4Ig和OX40Ig分子;AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig、AdCTLA4Ig和AdOX40Ig感染的Lewis大鼠脾细胞(刺激细胞)对Balb/c小鼠的脾细胞(反应细胞)的增殖均具有抑制作用,但AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig感染组的抑制效率明显强于AdCTLA4Ig和AdOX40Ig感染组,体外实验证实该两种分子可协同作用,强烈抑制混合淋巴细胞反应.     

胰腺十二指肠同源框-1基因促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞

虽然骨髓间充质干细胞(BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells)具有极强的自我更新能力及多向分化潜能, 但最近发现其体外分化为胰腺内分泌细胞的效率并不高, 不能产生足够用于移植的胰岛样细胞. 胰腺十二指肠同源框-1基因(Pdx-1, pancreatic duodenal homeobox-1)在胰腺胚胎发育和胰岛素基因表达调控方面均具有重要作用, 因此构建含有Pdx-1的真核表达载体, 并使用新型纳米介质Superfect介导重组载体转染BMSCs, 研究Pdx-1表达在BMSCs体外分化为胰岛样细胞中的作用. 结果表明, 转染重组载体后(Pdx-1⁺ BMSCs)分化为胰岛素阳性细胞比例为(28.23±2.56)%, 较转染空白载体和未转染组(Pdx-1-BMSCs)明显增多(分别为(7.08±2.69)%和(4.59±3.02)%); 细胞免疫化学染色显示诱导后细胞表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素蛋白, 而且Pdx-1⁺ BMSCs诱导后表达明显增加, 与Western blotting和RT-PCR结果相似; 葡萄糖诱导的胰岛素分泌量测定显示Pdx-1⁺ BMSCs对不同浓度葡萄糖有不同的胰岛素分泌, 25和5.5 μmol/L葡萄糖刺激后胰岛素分泌量分别为(115.29±2.56)和(56.61± 4.82) μU/mL, 明显高于Pdx-1^- BMSCs分泌量(分别为(53.26±7.56)和(25.53±6.49) μU/mL). Pdx-1⁺ BMSCs分化的细胞同种异体移植后可以恢复糖尿病模型大鼠的血糖水平, 移植物平均存活时间(30.5±15.7)天. 本试验提示大鼠BMSCs体外能分化为胰岛样细胞; Pdx-1能显著增强上述分化能力; BMSCs体外分化的胰岛样细胞移植能改善STZ糖尿病大鼠的生存状态. 这将为糖尿病的治疗提供一条新的途径.     

血红素加氧酶-1可能经诱导 foxp3+CD4 +CD25 + Treg细胞抑制哮喘气道炎症

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)作为体内保护蛋白, 在哮喘气道炎症中具有显著的抗炎作用. foxp3+CD4 ⁺CD25 ⁺ T调节细胞(T regulatory cells, Treg)是调节性细胞的主要组成部分, 以抑制的方式调控其他效应细胞的活性和功能. IL-10是多种细胞分泌的抗炎细胞因子, 具有免疫抑制功能. 本研究探讨HO-1诱导foxp3 ⁺CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 增加IL-10分泌以拮抗哮喘气道炎症. 选用磁珠分离CD4⁺CD25⁺ Treg, 含 HO-1 质粒转染或血红素(Hemin)和锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin, SnPP)处理, RT-PCR和Western blot方法检测显示Hemin上调HO-1表达, CD4⁺CD25⁺ Tregfoxp3 表达及蛋白水平显著增加, ELISA方法测定上清液IL-10水平明显升高. 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏、激发的哮喘小鼠, Hemin上调HO-1表达, 肺和脾脏中foxp3表达及蛋白量亦增加, 血清IL-10增高, 而OVA特异性IgE水平降低. 肺病理组织学检测、支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid, BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)计数均显示炎性细胞尤其是EOS浸润减少; CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg功能抑制实验发现, OVA致敏、激发Balb/C小鼠经Hemin干预后, 抑制作用显著增加; SnPP能逆转HO-1作用. IL-10剔除的B6.129P2-Il10^tm1Cgn/J小鼠Treg抑制作用经Hemin干预后仍未改善. 但体内外实验发现TGF-β水平无变化. 本研究表明: HO-1可能经诱导CD4 ⁺CD25⁺ Treg 特异性转录因子foxp3表达, 激活CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg, 促进IL-10分泌, 以拮抗哮喘气道炎症.     

HIV-1复合多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒疫苗的构建及小鼠免疫原性

将HIV-1 p24基因插入至人工设计的复合多表位基因MEG中, 获得嵌合基因MEGp24; 将MEGp24插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游, 构建出鸡痘病毒重组转移质粒; 经转染和BrdU加压筛选, 以基因组PCR和Western blot法筛选出重组病毒; 将重组病毒大量制备并纯化后, 分别于0, 14, 42天肌肉注射免疫BALB/c小鼠; 第3次免疫后一周, 采集小鼠全血与脾脏, 分离血清并无菌制备脾淋巴细胞, ELISA法检测小鼠血清HIV-1抗体、脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-α和IL-2的含量, 流式细胞仪测定CD4⁺, CD8⁺ T淋巴细胞亚类数量, 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性. 结果表明, 重组病毒刺激小鼠产生HIV-1特异性抗体, 出现T细胞亚类数量增加, 产生针对HIV-1 H-2^d限制性CTL表位的特异性靶细胞杀伤作用, 同时免疫小鼠脾细胞在HIV-1抗原肽的刺激下分泌Th1类细胞因子的水平大幅增加. 研究提示多表位嵌合基因重组FPV疫苗具有良好的免疫原性, 可诱导小鼠产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.     

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量

观察p18^INK4C (p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18^-/-)纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18^+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18^-/-细胞与p18^+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

snthr-1Bao稀毛小鼠突变基因的精确定位及克隆鉴定

snthr^-1Bao稀毛小鼠是本实验室培育的呈单基因隐性遗传的突变系小鼠,突变基因已被初步定位于第9号染色体末端;为了精确定位并鉴定snthr^-1Bao稀毛小鼠的突变基因,将(C57BL/6J×snthr^-1Bao)F₁代互交繁殖F₂代小鼠4 400余只,其中稀毛小鼠1 100只,并在2个微卫星、35个可能的简单序列重复标记（simple sequence repeat,SSR）及3个酶切扩增多态性序列（c1eaved amplified polymorphic sequences,CAPS）标记中找到4个合适的基因组标记。利用这些标记及F₂代稀毛小鼠将突变基因精确定位到第9号染色体距着丝粒117.763 kb及119.129 kb之间1.367 Mb的范围内,在其间的21个基因中确定Plcd1为稀毛突变的强力候选基因。通过对基因组的直接测序,发现snthr^-1Bao稀毛小鼠基因组上有一个14 883 bp的缺失,这一缺失包含了Plcd1基因的4—15号外显子及Vill基因的10—19号外显子。推测极可能是Plcd1基因缺失导致snthr^-1Bao小鼠出现稀毛表型。     

CTLA4基因修饰骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化及其免疫抑制功能研究

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stern cels,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.诱导后的细胞可表达AFP、Alb和CK18等肝细胞标志,同时还具有储存糖原和摄取、排泌靛青绿等肝细胞功能.转基因BMMSCs在未经诱导和诱导后均可表达CTLA4Ig,诱导14天时表达量有所减弱.单向混合淋巴细胞反应证实,诱导7天的转基因BMMSCs具有明显的抑制淋巴细胞反应的作用,其抑制作用明显高于未转基因BMMSCs,且CTLA4Ig基因修饰BMMSCs输注还可以明显延长肝移植大鼠的存活时间.用重组腺病毒Ad-CTLA4Ig对BMMSCs进行基因修饰,一方面不会影响BMMSCs的肝细胞分化潜能,另一方面使BMMSCs的免疫抑制特性得到进一步强化.     

血红素加氧酶-1介导CD4+CD25High调节性T淋巴细胞拮抗哮喘气道炎症的实验研究

探讨血红素加氧酶-1(HO-1, heme oxygenase-1)介导CD4⁺CD25^High调节性T淋巴细胞(Treg, regulatory T cells)拮抗哮喘气道炎症的作用. 用卵清蛋白(OVA)致敏、激发小鼠制备并建立哮喘动物模型, 并在致敏、激发过程中经氯化高铁血红素(Hemin)或锡-原卟啉(SnPP, Sn- protoporphyrin)处理. 分别测定激发后各组动物血清OVA特异性IgE, 支气管肺泡灌洗液中(BALF, bronchial alveolar lavage fluid)细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS, eosinophil)数及外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞变化和肺组织HO-1和Foxp3 mRNA表达量, 结合病理切片分析气道炎症状况. 结果显示: OVA组、Hemin组、SnPP组血清OVA-特异性IgE和BALF中细胞总数及EOS数明显高于正常对照组, 但Hemin组IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数明显低于OVA组; 而OVA组和SnPP组间IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数无显著性差异; 病理组织学显示OVA组、Hemin组和SnPP组气道组织均见EOS浸润, 但Hemin组气道炎症仍明显轻于OVA组和SnPP组; Hemin组外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞比例及肺组织Foxp3 mRNA相对表达量明显高于OVA组. Hemin显著上调HO-1表达. 实验表明, 用Hemin诱导HO-1高表达后外周血CD4⁺CD25^High Treg细胞比例及Foxp3 mRNA相对表达量明显升高, 同时血清OVA特异性IgE明显下降, BALF中细胞总数和EOS数减少, 气道炎症减轻; 提示HO-1可通过提高CD4⁺CD25^High Treg细胞比例并增强其功能来调节体内Th1/Th2平衡, 在支气管哮喘中起到保护作用.     

携带OX40L重组溶瘤病毒的构建及靶向杀伤肝癌的研究

目的 拯救携带OX40L的重组溶瘤流感病毒株，全面鉴定并评价其靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法 将编码OX40L的基因片段嵌合在A/PuertoRico/8/34（PR8）的NS片段特定位置，利用反向遗传学技术（reverse genetics，RG），与PR8流感病毒的剩余7个骨架质粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M共转染COSⅠ/MDCK细胞，成功拯救获得重组溶瘤流感病毒，命名为rFlu-OX40L。经血凝、TCID₅₀方法测定病毒滴度；重组病毒纯化后电镜观察病毒形态特征及大小分布；检测MDCK细胞病毒生长曲线；MTS法检测重组病毒对肝癌细胞活力的影响；流式细胞术检测重组病毒诱导肝癌细胞死亡方式；利用肝癌荷瘤小鼠模型评价重组病毒rFlu-OX40L在动物体内的抗肿瘤效果。结果 重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L可在鸡胚中稳定传代，HA效价达2^7~8，病毒滴度可达 7~8 LgTCID₅₀/ml；重组病毒rFlu-OX40L与流感病毒PR8生长曲线相一致，72 h达高峰；MTS结果显示，3 MOI重组病毒可显著降低肝癌细胞活力，且对正常肝细胞无明显影响，呈时间和剂量依赖性；流式细胞结果显示，重组病毒可显著诱导肝癌细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性；利用肝癌荷瘤小鼠模型，瘤内注射重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L较PR8、PBS对照组，小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD69+ T细胞数量呈现显著升高趋势。结论 携带OX40L的重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L在体内外均可选择性杀伤肝癌细胞，有望为肝癌的临床治疗提供新的免疫治疗策略。     

联合应用共刺激通路阻断剂诱导小鼠记忆性心脏移植耐受的研究

目的 探索联合应用共刺激通路阻断剂诱导记忆性心脏移植耐受的方法。方法 皮肤预致敏小鼠,过继转移同种反应性记忆性T细胞(Tm),构建小鼠同种异体心脏移植模型后再联合阻断效应及Tm激活途径,通过观察各组移植物平均存活时间、移植物排斥程度,检测脾脏中CD44高表达细胞数、脾细胞增殖情况和移植物中相关基因相对表达量等指标探讨其可能的作用机制。结果 (1)未处理小鼠脾脏中Tm占6.52﹪,而预致敏小鼠脾脏中Tm占26.5﹪;(2)平均存活时间为对照组5.17d,联合应用CTLA4Ig和anti-CD40L(二联用药)组10.33d,再联合应用anti-LFA-1和anti-OX40L(四联用药)组均>100d;(3)移植物排斥对照组均为4级,二联用药组?3B级,四联用药组为0级;(4)只有对照组脾脏物中CD44高表达;(5)对照组与二联用药组脾细胞增殖程度(t=2.91,P=0.027)明显高于四联用药组;(6)治疗组的移植物中IL-2、IFN-γ和Foxp3基因的表达量明显低于对照组(t=6.51,t=9.94,t=6.15,P=0.00,P=0.00,P=0.00),并且四联用药组IL-10基因表达量明显升高(t=4.71,P=0.003)。结论 对于记忆性心脏移植模型,只有联合阻断效应和Tm才可获得移植物长期耐受,其机制可能是明显降低移植物和移植受者细胞免疫应答水平的同时,诱导移植物中表达大量IL-10分泌性Tr1细胞。     

微小腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应, 延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间, 制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ, 同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照. 经CsCl超离心纯化, AdGTi’Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8%. 分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞, hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3) μg/(10⁶∙24 h)和(1.4±0.2) μg/(10⁶∙24 h). 血友病B小鼠分别腹腔注射1×10¹⁰ pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ, 小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690 ng/mL, 表达时间分别持续了16和10周. 与血友病B小鼠相比, 出血时间从原来的超过30 min缩短到7.5 min, 5 min内失血量从原来的430 μL减少到60 μL. 免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明, 微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比, 在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低. 结果表明, 微小腺病毒与第1代腺病毒相比, 同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达, 而且在动物体内的表达时间上有所延长, 病毒引起的免疫反应强度则明显降低, 为进一步的研究提供了实验依据.     

基于地形因子的藏狐生境评价及其空间容纳量的估算

依据藏狐的“出现点”数据,基于藏狐对家域内地形因子的利用,作者对青海省都兰县沟里乡野生藏狐的生境质量进行初步评价,并在基于个体藏狐最小空间需求的基础上,估算了研究地区的空间环境容纳量。 选择海拔、坡度、坡位和地形起伏度等4个主要的地形因子,应用Bonferroni置信区间比较藏狐对各因子的利用及其可获得性来建立单个因子评价准则,并依据各因子的分布特征进行综合生境评价。研究结果：藏狐最适宜的海拔高度为4 050～4 300 m,坡度为5～20°,坡位为上坡位和下坡位;藏狐对地形起伏度因子没有明显的选择性。根据藏狐对不同生境因子的利用,及不同藏狐个体生境利用的一致性,建立的综合评价准则为：X i=（X²_海拔×X²_坡位×X_坡度×X_{地形起伏度}）^1/6。研究地区内适宜性区域面积约为17.4 km²,占总研究地区面积的38.8%,其中最适宜生境仅0.4 km²。藏狐家域面积从2.53 ～4.99 km²不等,不同个体间家域重叠指数（OI）从0.16～0.66不等。藏狐的最小空间需求为2.09～3.55 km²,研究地区藏狐的空间容纳量为7～12只。根据生境资源现状及监测结果表明,研究地区的藏狐种群数量保持稳定。     

醌类光敏剂HA, HB与纳米半导体CdS间的光生电子传递——HA-CdS, HB-CdS复合体光敏还原动力学的EPR研究

根据非均相体系电子传递动力μ =E_s*/s+-E_CB(μ＜0)的原理,构建出相匹配的HA-CdS和HB-CdS复合体(以下简称Hys-CdS,Hys代表HA,HB).在该体系中,¹Hys*向CdS导带传递电子是热力学允许的.通过荧光淬灭实验,测出它们之间的表观结合常数(K_app )分别为940 (mol/L)^-1(HA-CdS),934(mol/L)^-1(HB-CdS),表明Hys与CdS间存在较强烈的吸附效应.荧光寿命测定得¹Hys*向CdS导带传递电子的速率常数K_et分别为5.16×10⁹s^-1(HA-CdS), 5.10×10⁹s^-1(HB-CdS).以一种稳定的氮氧自由基TEMPO(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperdinyloxy)作为电子受体,当它接受一个电子和一个质子,其EPR(electron paramagnetic resonance)信号便会消失,据此,应用消自旋的EPR技术,定量研究了苝醌类光敏剂Hys与纳米半导体CdS间光生电子传递动力学,确定了受Hys光敏化作用的CdS纳米半导体表面光还原速率方程和反应动力学速率常数,结果发现,本体系中TEMPO接受电子的反应级数均为0,而不同于均相体系中的反应级数,特别是在相同可见光照射条件下,通过比较单独的CdS与Hys–CdS复合体的光还原速率常数还发现,后者的光还原效率比前者均大,约为350倍,表明Hys对CdS纳米半导体具有显著的光敏化作用.这提示在太阳能应用中,Hys是一种很有效的光敏化剂.     

辛伐他汀对IFN-y诱导的人外周血单个核细胞OX40L表达的影响

目的：探讨经IFN-y刺激后,人外周血单个核细胞OX40L表达的变化,以及辛伐他汀对单个核细胞OX40L表达的影响。方法：将实验标本随机分为2组,分别干扰素-y（IFN-y）刺激组、辛伐他汀干预组。应用RT—PCR及Western blotting技术,观察IFN-y诱导的人外周血单个核细胞OX40L表达情况及辛伐他汀对人单个核细胞OX40L表达的影响。结果：1．1000U／ml IFN-与人单个核细胞共同培养24h后,OX40LmRNA和蛋白水平的表达明显增加。2．预先给予10mol／L的辛伐他汀干预1h可以明显降低IFN-诱导的OX40L表达。结论：IFN-可诱导人单个核细胞OX40L表达。辛伐他汀可以抑制IFN-诱导人单个核细胞OX40L表达的增强,从而可能抑制了OX40L信号通路介导的与炎症有关的血管损伤,延缓动脉粥样硬化的进程。     

辛伐他汀对IFN-γ 诱导的人外周血单个核细胞OX40L 表达的影响

目的:探讨经IFN-γ刺激后,人外周血单个核细胞OX40L表达的变化,以及辛伐他汀对单个核细胞OX40L表达的影响.方法:将实验标本随机分为2组,分别干扰素-γ(IFN-γ)刺激组、辛伐他汀干预组.应用RT-PCR及Western blotting技术,观察IFN-γ诱导的人外周血单个核细胞OX40L表达情况及辛伐他汀对人单个核细胞OX40L表达的影响.结果:1.1000U/mlIFN-与人单个核细胞共同培养24h后,OX40L mRNA和蛋白水平的表达明显增加.2.预先给予10 mol/L的辛伐他汀干预1h可以明显降低IFN-诱导的OX40L表达.结论:IFN-可诱导人单个核细胞OX40L表达.辛伐他汀可以抑制IFN-诱导人单个核细胞OX40L表达的增强,从而可能抑制了OX40L信号通路介导的与炎症有关的血管损伤,延缓动脉粥样硬化的进程.     

Cloning and sequencing of nifBHDKENX genes of Paenibacillus massiliensis T7 and its nif promoter analysis

A 324 bp of nifH fragment was PCR amplified from Paenibacillus massiliensis T7 using the universal degenerate primers. The PCR-amplified nifH fragment was labeled with DIG and then used as a probe in Southern blot analysis. Southern blot result showed that there were two positive signals, indicating that there might be two copies of nifH in P. massiliensis T7. A total of 10254 bp DNA sequence containing purD and nifBHDKENX was obtained by five rounds of inverse-PCR amplification. The predicted proteins of nifBHDKENX had high homology with those from other nitrogen-fixing bacteria. Only one putative σ⁵⁴-dependent promoter sequence was detected upstream of the nifB gene and nifBHDKENX were likely to be organized in one operon. Assays of β-galactosidase activity of P. massiliensis T7PB carrying a nifB-lacZ fusion under different concentrations of NH⁺₄ and O₂ showed that the expression of nifB-lacZ was strongly inhibited by O₂.     

短期CO2加富对凤梨光合作用及生长发育的影响

 研究了CO₂加富对丹尼斯凤梨（Guzmania`Denise’）和吉利凤梨（Guzmania `Cherry’）叶片光合速率、植株生长、开花和光合相关酶活性的 影响。结果表明,处理30 d期间,处理(600±40)、(900±40) μmol CO₂&;#8226;mol^-1的净光合速率分别比同期对照增加了6.24%～31.91%和11.92%～ 41.48%;CO₂加富下促进了叶片中可溶性糖和淀粉的积累, 蒸腾速率和气孔导度下降,Rubisco活性增加,乙醇酸氧化酶活性则明显下降。(600 ±40)μmol CO₂&;#8226;mol^-1处理下的株高、叶面积分别比同期对照下增加了6.94%～14.63%和1.66%～7. 06%,而处理(900±40) μmol CO₂&;#8226;mol^-1下 分别增加了9.71%～20.85%和2.87%～11.62%;CO₂加富下促进了干重和鲜重的积累。此外,CO₂加富提前了吉利凤梨的花期。     

东北地区陆地生态系统生产力及其人口承载力分析

 日益增长的人口及其生存环境问题已经成为人类社会生存与可持续发展的关键,亦是区域生态承载力的重要指标。生态系统生产力及其人口承 载力研究不仅可以弄清某一区域所能承载的最大人口数量,而且能为农业生态系统的宏观调控和长远发展规划提供依据。东北老工业基地地处 地球环境变化速率最大的东亚季风区,以气候变暖为标志的全球变化必将影响东北地区生态承载力,进而影响该地区的人口承载力。该研究基 于10 km×10 km 分辨率的东北地区1980～2002年共23年的气象资料,结合植物生理生态特点和水热平衡关系建立的自然植被净第一性生产力模 型和农业生产力模型,借助于地理信息系统软件,分析了东北地区4类生态系统类型：森林、农田、草地和湿地的生产力及其动态,指出东北地 区近23年来年均气温呈显著上升趋势、年降水总体上呈减少趋势。23年来东北地区植被年均总生产力为3.52×10¹¹ kg DM&;#8226;a^－1,其中森林、农 田、草地和湿地的年均总生产力分别为1.53×10¹¹、4.55×10¹⁰、1.07×10¹¹和4.63×10¹⁰ kg DM&;#8226;a^－1,森林、农田、草地和湿地的平均生产 力为5.73×10³、1.84×10³、5.64×10³和5.55×10³ kg DM&;#8226;hm^-2&;#8226;a^－1。在此基础上,以第一性生产-第二性生产之间的生态适应性和能量-物 质流平衡(在食物链上传递机制)为主线,通过对第一性生产力在人类直接消费与第二性生产之间以及各畜群(猪、肉牛羊、禽、奶牛和水产品( 鱼))之间的分配 ,估算了1980～2002年东北地区在宽裕型、小康型与富裕型3种消费水平下,不输出商品粮和每年向国家提供350×10⁸ kg商品 粮条件下的年均总人口承载力分别为2.61×10⁸、2. 15×10⁸和1.77×10⁸;和1.70×10⁸、1.40×10⁸和1.15×10⁸。因此,要确保东北地区每年 向国家提供350×10⁸ kg的商品粮,且在未来东北地区的生活水平要达到富裕型水平,必须控制人口数量。在此基础上,根据2020、2050、2070 和2100年的气候预估资料,预测了2020、2050、2070和2100 年东北地区在宽裕型、小康型和富裕型3种消费水平下的人口承载力分别为2.73× 10⁸、2. 25×10⁸和1.85×10⁸;2.88×10⁸、2.38×10⁸和1.95×10⁸;3.03×10⁸、2.49×10⁸和2.05×10⁸;以及 3.09×10⁸、2.55×10⁸和2.09 ×10⁸。该研究可为东北地区及各省的生态建设与土地资源可持续利用提供参考。     

GAP-43对Goα的激活及其构象变化基础

GAP-43和Go是富含于神经生长锥的膜外周蛋白. 用碱抽提法从牛脑皮层获得了高纯度的GAP-43, 同时在大肠杆菌表达系统中获得了高纯度的豆蔻酰化Goα. 测定GAP-43对Goa结合³⁵S-GTPγS活力影响的结果表明, GAP-43可显著促进GAP-43对Goα的GTPgS的结合活力, 且呈浓度依赖性. 用CaM-Sepharose亲和柱的实验结果表明GAP-43与GAP-43对Goα·GDP之间存在直接的相互作用. 这种相互作用所引起的Goα的构象变化的测定结果显示, GAP-43使Goα·GDP的色氨酸内源荧光发射谱谱峰蓝移4 nm, 其荧光强度增高35.3%, 并使其HB的猝灭效率明显增加, 其表观猝灭常数(Ksv)由(1.1±0.22)×10⁵增至(4.1±0.43)×10⁵ M^-1. 而GAP-43对GAP-43对Goα·GTPγS无明显影响, 表明GAP-43直接作用于GAP-43对Goα·GDP引起其构象变化, 从而加速GDP的解离和GTPγS的结合, 导致Goα的激活并启动G蛋白的循环实现信号的跨膜转导和放大. 研究结果对阐明信号转导介导分子G蛋白在偶联受体和效应器之间的作用机理提供了有力的实验证据, 对进一步深入揭示GDP和GTP的交换方式在G蛋白的循环中的关键作用提供了新的启示.     

尿素通道蛋白B基因敲除对小鼠心电图与心肌动作电位的影响

尿素通道蛋白B(UT-B)为介导尿素跨膜转运的通道蛋白, 在肾脏和其他肾外组织, 如红细胞、脑、心脏、膀胱和睾丸等组织、细胞中广泛表达. 为探讨UT-B缺失对心脏表型的影响,应用RT-PCR, Western blot检测UT-B mRNA, UT-B蛋白在野生型小鼠(UT-B^+/+)和UT-B基因敲除纯合子小鼠(UT-B^-/-)心脏组织的表达情况, 对比观察6, 16, 52周UT-B基因敲除纯合子(UT-B^-/-)与野生型小鼠肢体Ⅱ标准导联心电图, 应用悬浮微电极法记录分离的16周小鼠心室肌细胞动作电位各参数变化. 结果显示UT-B的mRNA和蛋白在UT-B^+/+小鼠心脏有表达, 而UT-B^-/-小鼠无表达; UT-B^-/-小鼠P-R间期((43.5 ± 4.2), (45.5 ± 6.9), (43.8 ± 7.6)ms)明显长于UT-B^+/+小鼠((38.6 ± 2.9), (38.7 ± 5.6), (38.2 ± 7.3)ms, P<0.05), 随增龄P-R间期无明显延长, 但老龄组(52周)Ⅱ度和Ⅲ度房室传导阻滞发现率超过20%; 动作电位记录结果显示UT-B^-/-小鼠的动作电位幅值(APA), 动作电位最大除极速度(V_max)与UT-B^+/+小鼠比较, 前者明显受到抑制(P < 0.05), 其APD50, APD90明显延长(P < 0.05). 总之, 本研究发现野生型小鼠心肌有UT-B表达, UT-B基因敲除导致小鼠进展型心脏传导阻滞, 提示UT-B在介导心肌电生理特性方面有重要作用.