n-3多不饱和脂肪酸对2型糖尿病患者血脂及炎症因子的影响

【摘要】 目的 ①观察不同成分的n-3PUFA对2型糖尿病患者血脂水平的影响;②观察不同成分的n-3PUFA对2型糖尿病患者C反应蛋白和白介素-6的影响。方法采用随机双盲对照方法,将108例2型糖尿病患者随机分为3组,分别服用含有不同成分（ALA、EPA、DHA)的 n-3PUFA胶囊4g/d,观察时间为6个月,A组（金枪鱼油组,胶囊成分n-3PUFA-DHA+EPA）,B组（亚麻籽油组,胶囊成分为n-3PUFA-ALA）,C组（玉米油组,对照组）。分别在基线、3个月、6个月时检测血脂、白介素-6和C反应蛋白等实验数据,进行统计学分析。结果①组内比较： A组在3月时HDL较治疗前升高,其差异具有统计学意义（p<0.05）,6月时具有显著统计学差异（p<0.01）;6月时,TC水平较治疗前降低,其差异具有统计学意义（p<0.05）;B组和C组3月、6月时,血脂无明显变化（均p>0.05）。组间比较：3月时,三组患者血脂水平均无显著差异（均p>0.05）;6月时A组和C组之间HDL水平差异具有统计学意义（p<0.05）。②组内比较：A组CRP和IL-6水平在3月时均较治疗前降低,其差异具有统计学意义（p<0.05）,6月时具有显著统计学差异（p<0.01）;B组和C组3月、6月时,CRP和IL-6水平无明显变化（均p>0.05）。组间比较：3月时,三组CRP和IL-6水平均无显著差异（均p>0.05）;6月时A组和C组之间CRP和IL-6水平差异具有统计学意义（p<0.05）。 结论 ①服用n-3PUFA（金枪鱼油,胶囊成分n-3PUFA-DHA+EPA ）4g/d可以升高2型糖尿病患者高密度脂蛋白,同时降低总胆固醇水平;②服用n-3PUFA（金枪鱼油,胶囊成分n-3PUFA-DHA+EPA ）4g/d可以降低糖尿病患者C反应蛋白和白介素-6水平。     

A study of gene transfer and expression of human clotting factor IX in hemophilia B mice mediated by mini-adenoviral vector

Vector Gti'IX containing human clotting factor IX cDNA with intron 1 (hFIX mini-gene or Fi'IX) driven by CMV promoter was constructed based on the mini-adenoviral vector GT2073 (mini-Ad vector) with all viral protein coding sequences deleted. Mini-Ad packaging cell 293Cre4 was first transduced with Gti'IX, and then was transfected with helper-adenovirus AdLC8, thus mini-Ad virions AdGTi'IX were obtained. At the same time, previous normal adenoviral vector pAdSPi'IX containing viral genome and hFIX mini-gene was constructed, and then previous adenovirus (pre-Ad) AdSPi'IX was obtained as control. The ratio of helper-adenovirus among purified virons AdGTi'IX was less than 0.8%. 3T3 cells were transfected with AdGTi'IX and AdSPi'IX at a MOI of 50 per cell and ELISA result showed that transient expression level in vitro was 1.4±0.2 μg /106@24 h and 1.6±0.3 μg/106@24 h respectively. Each hemophilia B (FIX knock-out) mouse received celiac injection of 1×1010pfu AdGTi'IX or AdSPi'IX. The highest expression level of hFIX in mouse plasma was 590 ng/mL and 690 ng/mL respectively, and the expression time lasted for 16 weeks and 9 weeks respectively. The bleeding time reduced from over 30 min to 7.5 min, and 5-min blood lost reduced from 430 μL to 60 μL. The results of anti-Ad IgG assays indicated that immune response triggered by AdGTi'IX was obviously weaker than that triggered by AdSPi'IX. These results indicated that, compared with previous adenovirus (pre-Ad), the mini-Ad vector system prolonged the expression time of hFIX and reduced immune response, thus offering a promising result for further pre-clinical study.     

n-3多不饱和脂肪酸与2型糖尿病关系的研究进展

综述了n-3多不饱和脂肪酸是否可以减少或延缓健康人群发生糖尿病及其血管并发症的风险,以及2型糖尿病患者中外源性n-3多不饱和脂肪酸的摄入是否可以改善胰岛素抵抗和降低心血管疾病并发症的发生发展的临床研究进展,从而探索其在医学营养治疗学中的应用价值。     

微小腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应, 延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间, 制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ, 同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照. 经CsCl超离心纯化, AdGTi’Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8%. 分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞, hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3) μg/(10⁶&#8729;24 h)和(1.4±0.2) μg/(10⁶&#8729;24 h). 血友病B小鼠分别腹腔注射1×10¹⁰ pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ, 小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690 ng/mL, 表达时间分别持续了16和10周. 与血友病B小鼠相比, 出血时间从原来的超过30 min缩短到7.5 min, 5 min内失血量从原来的430 μL减少到60 μL. 免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明, 微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比, 在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低. 结果表明, 微小腺病毒与第1代腺病毒相比, 同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达, 而且在动物体内的表达时间上有所延长, 病毒引起的免疫反应强度则明显降低, 为进一步的研究提供了实验依据.     

Skeletal muscle-specific expression of human blood coagulation factor Ⅸ rescues factor Ⅸ deficiency mouse by AAV-mediated gene transfer

The efficacy of recombinant adeno-associated virus (AAV) vector to deliver and express human blood clotting factor DC (hFIX) gene in skeletal muscle of coagulation factor IX deficiency mouse strain (FactorIX-knockout) is e-valuated. The muscle creatine kinase enhancer (MCK) and βactin promoter ((3A) were used to drive the hFIX minigene (hFIXml), which was flanked by AAV inverted terminal repeats (ITRs). Following intramuscular injection of high liter (2.5 x 1011 vector genomes/mL) of AAV, increased hFIX expression (256 ng/mL of plasma) was achieved. The time course of hFIX expression demonstrated that the expression level gradually increased over a period of two weeks before anti-hFIX antibodies developed in mouse circulating plasma. Those results provided a promising evidence that rAAV-me-diated gene transfer and skeletal muscle-specific expression of hFIX is a feasible strategy for treating patients for hemophilia B.     

微小腺病毒介导的人凝血因子IX基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应,延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间,制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ,同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照。经CsCl超离心纯化,AdGTi‘Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8％。分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞,hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3)μg/(10~6·24h)和(1.4±0.2)μg/(10~6·24h)。血友病B小鼠分别腹腔注射1×10~(10)pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ,小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690ng/mL,表达时间分别持续了16和10周。与血友病B小鼠相比,出血时间从原来的超过30min缩短到7.5min,5min内失血量从原来的430μL减少到60μL。免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明,微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比,在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低。结果表明,微小腺病毒与第1代腺病毒相比,同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达,而且在动物体内的表达时间上有所延长,病毒引起的免疫反应强度则明显降低,为进一步的研究提供了实验依据。     

微小腺病毒载体介导的人凝血IX因子小基因的离体表达

将带有内源内含子的人凝血ＩＸ因子ｃＤＮＡ（ｈＦＩＸ小基因）构建到不含腺病毒基因而只带有反向末端重复顺序（ＩＴＲ）和包装信号ψ等顺式元件的微小腺病毒（ｍｉｎｉ－ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）载体ＧＴ２０７３上,得到载体ＧＴｉ’ＩＸ。将该载体与带有ｌａｃＺ报告基因的微小腺病毒载体ｐＲＰ１００１分别转移４入腺病毒馐细胞２９３Ｃｒｅ４中,随后专杂辅助病毒ＡｄＬＣ８,从而馐出微小腺病毒ＡｄＧＴｉ’ＩＸ和ＡｄＲＰ１０     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

狗凝血Ⅸ因子cDNA的克隆及其离体表达研究

根据cFⅨcDNA(canineFⅨ ,cFⅨ )顺序设计引物 ,采用RT PCR技术 ,从狗肝细胞中提取mRNA ,逆转录成cFⅨcDNA ,克隆到pGEM T质粒载体上 ,经DNA顺序分析 ,挑选克隆 ,拼接并测序鉴定 ,得到DNA顺序完全正确且含有cFⅨ完整编码区的cDNA ,进一步构建成以G1Na为框架的反转录病毒载体G1NaCcⅨ (hCMV启动子控制cFⅨ转录 )和G1NaMBcⅨ (MCK增强子和β actin启动子共同控制cFⅨ转录 ) ,并用于反转录病毒介导的基因转移 .狗原代皮肤成纤维细胞实验结果显示 ,cFⅨ能够在狗皮肤成纤维细胞中表达 ,表达水平分别为G1NaCcⅨ :173ng/ 10 6 细胞·2 4h ;G1NaMBcⅨ :2 11ng/ 10 6 细胞·2 4h .此结果为血友病B狗基因治疗动物试验的开展奠定了基础 .