SARS病毒受体ACE2的克隆、原核表达及其功能区鉴定

ACE2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)是SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome associatedcoronavirus,SARS-CoV)的主要受体。此研究旨在鉴定ACE2的SARS-CoV受体功能区,为进一步阐明SARS-CoV与细胞间的相互作用机制及研制抗病毒药物等提供理论依据。利用RT-PCR从Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩增ACE2基因,其中N端片段ACE2A1-367(102~1 210nt)不包括ACE2的酶活性位点(1 223~1 237nt,或374~378aa),而C端片段ACE2B335-805(1 101~2 524nt)包括ACE2的酶活性位点。扩增片段克隆入pMD-18T,并进行测序鉴定。进一步构建与GST基因融合表达的原核表达质粒pGEX-ACE2A与pGEX-ACE2B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白分子量为65kD和77kD,主要以包涵体形式存在。Western blot证实表达产物具有免疫学活性。将纯化的包涵体蛋白质复性后进行Western blot分析,证实pGEX-ACE2A表达的蛋白(~65kD)能与SARS-CoV S1蛋白特异结合,而pGEX-ACE2B表达的蛋白(~77kD)不能与S1蛋白结合。结果表明,ACE2的受体活性与酶活性位点无关,受体功能区在ACE2 N端367个氨基酸内。     

单季稻小麦轮作区灰飞虱发生规律

为了明确单季稻-小麦轮作区灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén的发生规律,采用灯诱法、盘拍法、盘刮法、黄盘诱集法对灰飞虱周年发生,特别是在寄主转移时的消长规律进行了系统研究。结果表明:灰飞虱主要在适宜藏匿的场所越冬,其中常规耕翻田主要在田边田头的禾本科枯死杂草或其它密生植物、稻套麦田主要在田中稻残桩中,灰飞虱的越冬效率为50%⁶0%。稻套麦田灰飞虱夏冬寄主间的转移效率约为10%是常规耕翻麦田的20倍,其冬后基数分别是机械浅旋耕和常规耕翻田的35倍和77倍。灰飞虱周年只有一个迁移扩散高峰期,与小麦收割时间基本吻合。移栽后水稻上灰飞虱数量锐减,大田前期灰飞虱主要来源于秧苗带入的未孵化卵块。通过比较发现稻套麦优化了灰飞虱的越冬环境,是近年来灰飞虱大发生及其传播的水稻病毒病大流行的主要原因。根据上述研究结果提出了压低灰飞虱越冬基数是灰飞虱水稻病毒病能够得以有效控制的前提这一新观点。     

中国野鸦椿属植物化学成分及药理活性研究进展

野鸦椿属植物归属于省沽油科,主要分布于东亚以及东南亚,我国分布有两个种。该属植物化学成分结构丰富,包括酯类、三萜类、黄酮类等,药理活性广泛,如抗炎、抗肝纤维化、抗氧化等。本文从化学成分及药理活性方面对野鸦椿属植物的研究进行综述,以期为该属植物的深入研究与开发提供文献参考。     

131I标记Tyr-GX1在荷瘤裸鼠体内分布和显像研究

目的:设计、合成酪氨酸(Tyr)修饰的肿瘤血管靶向肽GX1,研究131I标记短肽Tyr-GX1在荷人胃癌裸鼠体内的生物学分布与显像,探讨131I-Tyr-GX1短肽作为肿瘤血管靶向诊治药物的可能性.方法:利用Iodogen碘标法对Tyr-GX1进行131I标记,检测其标记率和体内外稳定性;建立荷人胃癌裸鼠动物模型,尾静脉注射标记肽,分别进行体内生物学分布实验和肿瘤显像实验,结果用PASW Statistics 18.0统计软件进行分析.结果:1).纸层析法结果计算表明,131I-Tyr-GX1肽的标记率和放化纯均达90％以上;24 h稳定性测试表明,131I-Tyr-GX1在室温下存放以及与人血清、鼠血清、PBS等溶液混合,其标记率仍然都维持在90％左右,说明其具有良好的体内外稳定性;2).荷瘤裸鼠体内生物学分布研究显示:标记肽在荷瘤裸鼠双肾放射性计数测量最高;其次是肝脏、肿瘤等组织;脑、骨、肌肉组织放射性计数含量较低,给药24 h时,肿瘤/肌肉(T/M)、肿瘤/血液(T/B1)、肿瘤/脑组织(T/Br)的放射性比值分别是5.78、4.06和23.01;3).体内SPECT显像结果显示:尾静脉注射131I-Tyr-GX1肽后4h肿瘤部位已开始显影,并随时间的延长,显像逐渐清楚,至18h时,肿瘤显像最清晰.结论:应用Iodogen碘标法成功标记Tyr-GX1短肽;尾静脉注射131I-Tyr-GX1后,肿瘤部位可以出现放射性浓聚,表明131I-Tyr-GX1短肽可以靶向结合于肿瘤部位,有望成为新一种胃肠道肿瘤诊断与治疗的药物.     

乳酸乳球菌组成型表面展示载体的构建及鉴定

目的探索融合有Usp45信号肽和3Lys M锚定序列的EGFP蛋白能否通过p32启动子组成型展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法融合PCR法分别将p32启动子与Usp45信号肽、3Lys M与egfp基因融合亚克隆至p MD-18T载体,鉴定正确后命名为18T-p Usp45、18T-3Lys M-egfp,分别将上述片段切下依次插入p MG36e构建p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp。将其转化入乳酸乳球菌MG1363,荧光显微镜观察及SDSPAGE、Western-blot检测。结果成功构建重组菌p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp/MG1363,荧光显微镜、SDSPAGE和Western-blot检测表明重组蛋白能在MG1363中组成型表达,且分泌至胞外并锚定在细胞壁上。结论成功地构建了组成型表面展示载体p MG36e-p Usp45-3Lys M-egfp,重组蛋白能分泌至胞外且展示在MG1363细胞壁上。     

骨髓干细胞移植治疗肝硬化的基础与临床研究现状

肝硬化是一种临床常见的肝病良性终末期表现。目前临床上尚缺乏有效的治疗措施。肝脏移植是最理想的治疗方法,但受供体肝脏来源限制,且费用昂贵。近年来开展的自体骨髓干细胞(BMSCs)移植治疗,为肝硬化的治疗带来了新的希望。BMSCs主要包括造型血干细胞和间充质干细胞,其具有可塑性,体外通过生长因子,体内利用特定微环境均可诱导BMSCs分化为肝前体细胞和成熟肝细胞,并明显改善肝功能。从动物实验到临床研究亦表明,BMSCs具有来源丰富、费用低廉、损伤小、自体移植不栓塞、无排斥反应等优点,为治疗肝病带来了新思路,有望成为生物人工肝的细胞来源。本文就BMSCs移植治疗肝硬化的研究现状,尤其是移植途径以及在肝脏内定居、迁移和分化机制的示踪观察方法和存在的问题作一综述,以期为从事肝病研究的同仁提供参考依据。通过对BMSCs移植从基础研究及临床应用的最新进展的描述,展示BMSCs在肝硬化治疗方面良好的治疗前景。     

固氮施氏假单胞菌亚硝酸盐还原酶基因nirS转录特性及功能鉴定

【目的】研究固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501亚硝酸盐还原酶结构基因nir S的转录调控机制及其在反硝化过程中的功能。【方法】构建nir S-lac Z融合载体,利用三亲本结合法将其导入野生型A1501,通过β-半乳糖苷酶活性的测定,分析不同供氧状况、不同浓度的硝酸盐、亚硝酸盐对nir S基因表达的影响;同时将该载体导入rpo N突变株中,研究氮代谢调控因子Rpo N对nir S基因转录影响。通过同源重组方法构建nir S突变株,通过生化表型测定明确nir S在反硝化过程中的功能。【结果】启动子活性测定表明,nir S基因厌氧条件下高水平表达,是好氧条件下表达水平的4倍;nir S的表达受硝酸盐诱导,但不受亚硝酸盐的诱导;Rpo N突变株中,nir S的表达活性为野生型的1/4,nir S启动子未发现Rpo N的保守结合位点,表明nir S的表达受Rpo N间接调控。表型测定显示以硝酸盐为电子受体时Δnir S的反硝化能力降低了约20%;以亚硝酸盐为电子受体时Δnir S仅有微弱的反硝化能力,并且nir S的突变使得菌体在反硝化条件下利用亚硝酸盐的能力显著减弱。nir S突变提高了菌体在亚硝酸为电子受体的反硝化条件下的固氮酶活。【结论】A1501中nir S基因的转录受外界氧及硝酸盐的影响,同时受氮代谢Sigma因子Rpo N的调控。nir S在A1501菌反硝化过程中起关键作用,参与了亚硝酸盐的转化。     

外源亚精胺对Hg2+胁迫下凤眼莲抗氧化系统的影响

通过Hoagland溶液培养实验,研究了外源亚精胺(Spd)(0.1 mmol?L-1)对Hg2+(0、10、20、30和40μmol?L-1)胁迫下凤眼莲叶片细胞内叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化系统的调节作用.结果显示,(1)随Hg2+处理浓度的升高,各处理凤眼莲叶片叶绿素a(Chl a)和叶绿素b(Chl b)含量均先升后降,并均在10μmol?L-1时达到最高值,但外源Spd处理组显著高于相应对照.(2)各处理凤眼莲叶片可溶性蛋白含量随Hg2+处理浓度的升高也呈先升后降趋势,而可溶性糖含量则呈持续上升趋势,但外源Spd处理亦明显高于相应对照.(3)随Hg2+处理浓度的升高,抗氧化物质AsA和GSH含量及抗氧化酶SOD、CAT、POD、APX及GR活性也均呈先升后降的变化趋势,而外源Spd处理植株的含量和活性均显著高于相应对照.(4)各处理凤眼莲叶片的H2O2、MDA含量及O2?-产生速率随Hg2+处理浓度的升高均持续上升,但在外源Spd处理后均比对照组下降.研究表明,Hg2+胁迫使凤眼莲生长受到严重伤害,外源Spd可大幅度地提高其抗氧化物质含量和保护酶活性,从而增强凤眼莲抗Hg2+胁迫的能力.     

乙二醇对木瓜蛋白酶催化活性的影响

对不同浓度乙二醇水溶液影响木瓜蛋白酶水解酪蛋白的催化活性及构象的改变进行研究。结果表明,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中水解酪蛋白的活性显著下降。动力学测定表明,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中最大反应速度明显下降;差示光谱显示,在乙二醇水溶液中木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化;荧光发射光谱显示,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中发射峰位几乎没移动,但发射强度明显增高。     

甲醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响

试验结果表明,木瓜蛋白酶在一定浓度甲醇溶液中水解酪蛋白的活性显著上升;动力学测定表明,该酶在甲醇溶液中Km下降;在甲醇溶液中木瓜蛋白酶催化酪蛋白水解反应的最适pH为8.5,最适温度为70℃;紫外差示光谱研究表明,在甲醇溶液作用下木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化;荧光发射光谱研究表明,木瓜蛋白酶在甲醇溶液中发射峰位向低波长移动,荧光峰值明显增高。