ENU诱导带LacZ靶基因的λgt11

采用ENU(乙基亚硝基脲)作用于裸露的 λgt11 DNA,经体外重包装,转染宿主菌　E. coli Y1090,在含底物X-gal,诱导剂IPTG的选择性培养基上铺皿,发现被处理的 λgt11 DNA除了使噬菌体存活率下降外,还出现了靶基因“LacZ”较高频率的突变。其中以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂,当存活率分别为3.5×10-3、1.6×10-3和5.5×10-4 时,相应的突变率依次为1.1×10-3、3.2×10-3和5.2×10-3,DMSO溶剂对照突变率则<5.0×10-5 。对ENU诱导的5个阳性突变体进行了扩增,以PCR产物为模板,采用正向引导,对阳性突变体靶基因LacZ进行了部分测序,在被测序的260bp范围内,发现了9个位点的碱基突变。碱基突变的类型有颠换(67%)、转换(11%)和移码突变(22%)。颠换主要以A→T、G→C为主。似乎胞嘧啶(C)更易发生突变(占43%)。 Abstract　To construct molecular mutation detective system of λ DNA with LacZ, naked λ gt11 DNA was treated with mutagen ENU (Ethylnitro sourea). The ENU-damaged DNA was added to Lambda packaging extracts and the resulting phage were grown in host　E.coli　Y1090 on a selective plate containing substract X-gal and inducer IPTG. Under these conditions, the results showed that the higher the viability ratio was, the lower the frequency of clear-plaque mutants occured. In our study, when survival ratios of the host cell survival ratio were 3.5×10-3、1.6×10-3　and 5.5×10-4　respectively, the mutation ratio were 1.1×10-3、3.2×10-3　and 5.2×10-3　accordingly, and the mutation ratio by DMSO (negative control ) was below 5.0×10-5. 260 bases from ENU―induced LacZ　gene were subjected to DNA sequence analysis. There were several mutation sites: transversion (6, 67%), transition(1, 11%), frame shift(2, 22%)(both were insert mutation). Transversions mainly consisted of A→T, G→C. Among the four bases, cytosine seemed to be more sensitive to ENU (43%).     

氟氏链霉菌离子束注入突变谱的分析

用低能N⁺离子束注入转谷氨酰胺酶产生菌氟氏链霉菌后,通过试验,初步确定了注入的效应曲线,获得了一系列突变菌株。提取原始菌株和突变菌株的DNA,采用PCR反应分段扩增出转谷氨酰胺酶基因进行单链构象多态性分析(SSCP),并将特异性条带克隆测序进行基因突变型的鉴定,分析离子束注入引起链霉菌基因的基因突变类型及特点。结果显示:碱基变异的类型包括转换、颠换和缺失。在检测到的24个碱基突变中,主要是碱基的置换(87.5%),碱基缺失的比例比较小(12.5%)。在碱基置换中,转换的频率(58.3%)高于颠换的频率(29.2%)。转换主要以C→T,A→G为主,颠换以G→T,C→G为主。此外构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异,其中胞嘧啶发生突变的频率较高。     

低能N+辐照拟南芥诱导基因组DNA碱基变异分析

用低能N+离子束注入拟南芥后获得的稳定突变体T80Ⅱ作为实验材料, 对突变体植株进行了RAPD标记, 并将T80Ⅱ和对照部分RAPD特异条带进行克隆测序和DNA序列分析. 结果显示, 在可分辨的总计397个RAPD条带中, T80Ⅱ株系中有52个条带表现出差异, 包括条带的缺失和增加, 条带变异率为13.1%; 克隆的T80Ⅱ序列中, 平均每16.8个碱基出现1个碱基变异位点, 表现出较高频率的碱基突变. 碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入等. 在检测到的275个碱基突变中, 主要是单碱基置换(97.09%), 碱基缺失或者插入的比例较小(2.91%). 在碱基置换中, 转换的频率(66.55%)高于颠换的频率(30.55%). 此外, 构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异, 而且每一种碱基都可以被其他3种碱基所替换, 但是胸腺嘧啶(T)的辐射敏感性要高于其他3种碱基. 通过分析突变碱基周边序列, 对低能N+离子注入拟南芥突变体引发的碱基突变热点进行了讨论.     

离子注入诱变莲花突变体分子机理的初步研究

低能离子注入技术作为生物物理诱变的一种新型技术, 在园艺植物育种方面具有很大的应用潜力, 但其诱变的分子机理目前知之甚少。文章对Fe+ 离子注入诱变的白洋淀红莲(Nelumbium speciosum Willd)突变体及其对照的基因组进行RAPD研究, 并将突变体和对照在辐射敏感位点的条带进行克隆测序及DNA序列分析。在已优化好的RAPD体系下扩增, 从110条随机引物中筛选出了10条可以稳定扩增出显著特异条带的引物, 引物多态性为9.09%。将这10条引物扩增出的辐射敏感位点的条带进行克隆测序, 并进行序列比对。结果显示: 突变体的总碱基突变频率为0.87%, 6个突变体的碱基突变频率存在着差异; 碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入, 在检测到的159个碱基突变中, 单碱基置换的频率(61.01%)高于碱基插入或者缺失的频率(38.99%), 在碱基置换中, 转换的频率(44.65%)是颠换频率(16.35%)的2.7倍, 其中C/T之间的转换所占比例最大, A→G和A→T也具有较高的替换频率; 构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱变发生变异, 除了没有C→G的置换外, 每一种碱基都可以被其他的几种碱基所置换, 但是胸腺嘧啶(T)具有较高的辐射敏感性。通过对碱基突变位点周边序列的分析发现, 嘌呤突变位点的周围嘌呤碱居多, 嘧啶突变位点的周围嘧啶碱居多。研究结果为揭示低能离子注入诱变作用分子机理提供了依据。     

低能N+辐照拟南芥诱导基因组DNA碱基变异分析

用低能N~+离子束注入拟南芥后获得的稳定突变体T80Ⅱ作为实验材料,对突变体植株进行了RAPD标记,并将T80Ⅱ和对照部分RAPD特异条带进行克隆测序和DNA序列分析。结果显示,在可分辨的总计397个RAPD条带中,T80Ⅱ株系中有52个条带表现出差异,包括条带的缺失和增加,条带变异率为13.1％;克隆的T80Ⅱ序列中,平均每16.8个碱基出现1个碱基变异位点,表现出较高频率的碱基突变。碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入等。在检测到的275个碱基突变中,主要是单碱基置换(97.09％),碱基缺失或者插入的比例较小(2.91％)。在碱基置换中,转换的频率(66.55％)高于颠换的频率(30.55％)。此外,构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异,而且每一种碱基都可以被其他3种碱基所替换,但是胸腺嘧啶(T)的辐射敏感性要高于其他3种碱基。通过分析突变碱基周边序列,对低能N~+离子注入拟南芥突变体引发的碱基突变热点进行了讨论。     

γ射线诱导质粒pGEM-3Zf(-)DNA lacZ基因突变的序列分析

利用质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）ＤＮＡ上带有的ｌａｃＺ基因,通过Ｘ－ｇａｌ显色平板筛选经＾６０Ｃｏγ辐射诱导形成的突变体。对４个突变体的ｌａｃＺ基因进行序列分析发现,所有突变体无一例外地检测到碱基变化。在被测序的４８９ｂｐ范围内,一个突变体发生的碱基变异达２－７个位点。碱基变异的类型包括颠换（５７％）、转换（１９％）、缺失（１９％）及插入（５％）。在碱基置换中,以Ｃ／Ｇ→Ａ／Ｔ颠换最多（占５０％）。     

EMS对D6-2转基因小鼠骨髓组织细胞内lacⅠ靶基因的诱变率和诱变谱

对D6 -2转基因小鼠骨髓组织细胞内lacⅠ靶基因的自发突变率以及甲基磺酸乙酯 (ethylmethanesulfonate ,EMS)诱发的突变率和突变谱进行了研究 .将带有lacⅠ靶基因的pSPORT1质粒通过酶切、环化和转化DH1 0B宿主菌的方式从经和未经诱变处理的D6- 2转基因小鼠骨髓组织基因组DNA中回收出来 ,lacⅠ靶基因突变体用M9/L选择性平板进行正向选择 .结果从经EMS诱变处理的小鼠基因组DNA中回收出的约 1 1 935个pSPORT1质粒中筛选到 6个lacⅠ-突变体 (EMS诱发的突变率为 5 0× 1 0 ^-5 ) ,而从对照组小鼠基因组DNA中回收出的约 1 1 6 4 9个质粒中没有检测到lacⅠ^-突变体 (自发突变率则小于 8.6× 1 0 ^-5 ) .对 6个突变体的 2个突变高发区进行了序列分析 ,共检测出 1 6个点突变 .其中 ,碱基置换突变为主要突变类型 ,占 87.5 % ( 1 4) ,其余 1 2 .5 % ( 2 )的突变为缺失突变 .在碱基置换突变中 ,颠换占6 4 % ;而转换仅占 36 % ,这既不同于用BigBlue 转基因小鼠所测到的lacⅠ基因在小鼠体内的自发突变谱 ,又不同于用穿梭载体 /哺乳动物细胞系统所测到的EMS在体外的诱变谱 .而突变发生的位点则与其他的研究报道相同 ,主要出现在CpG二核苷酸 ,占全部点突变的 45 % .这些结果表明 :( 1 )基于含 pSPORT1质粒的D6- 2转基因小鼠是一个能用于研究体内基因突变的分子机理和评估化学物质的遗传毒性作用的有效模型 ;( 2 )EMS在体内和体外的诱变特性似有本质的不同 ,但这有待于进一步的研究证实     

ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的鉴定

采用化学诱变剂乙酰基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)获得一种常染色体显性遗传多趾突变小鼠(Mus musculus),该突变小鼠在后趾内侧(即轴前部)多出一个脚趾,且严重程度不一,部分小鼠双侧后足都有多趾表型。阿尔新蓝-茜素红染色结果表明,多趾突变杂合子小鼠除多趾异常发育外,其余骨骼无明显异常。为定位该突变基因,利用微卫星标记对(C57BL/6J×DBA/2J)F1代多趾突变小鼠回交C57BL/6J得到的[(C57BL/6J×DBA/2J)F1×C57BL/6J]N2代多趾小鼠进行全基因组扫描,最终将本例多趾突变基因定位于小鼠第2号染色体微卫星D2mit45与D2mit184之间,并初步确定Alx4为该突变候选基因。在此基础上对Alx4进行测序分析,测序结果发现突变小鼠Alx4基因编码区第433位碱基处发生A到T的颠换,导致编码区第145位密码子AAA(编码赖氨酸)变为终止密码子TAA,引起蛋白编码提前终止,是引起多趾表型的原因。     

百日咳疫苗用菌株基因的遗传稳定性研究

目的对百日咳疫苗(pertussis vaccine)用菌株的主要保护性抗原基因序列的遗传稳定性进行研究,进一步验证此前一代测序的结果,为疫苗的安全性和有效性提供依据。方法采用第二代测序技术(next generation sequencing,NGS)对百日咳疫苗生产用菌株的主代代次(P4)、工作代次(P7)、疫苗代次(P13)及疫苗代次后连续传3代的第3代样品V3代次(P16)的主要抗原基因序列进行测序并分析。采用ELISA和Lowry法对百日咳疫苗生产用菌株各代次主要抗原组分进行抗原含量检测及比活性检测。结果百日咳毒素(pertussis toxin,PT) S1亚基上的8个等位基因氨基酸相对应的24个碱基位点中最高突变率为0.38%,其中疫苗代次最高突变位点(A2789C0.92%)在S5亚基上,其他各代次最高突变位点均不在S亚基上。PT全基因组最高突变率4%,且同一个位点不同代次的碱基突变呈不规律性,突变率没有随传代次数的增加而增高。百日咳黏附素(pertactin,PRN)的24个抗原表位中最高突变率在疫苗代次T951G位点,突变率为1.66%;其他位点的突变率均0.8%。全基因组中突变率最高的位点为V3代次C2025T,突变率为6.24%;各代次PRN全基因组最高突变率6.24%,且不在主要抗原表位区域内;在同一个位点不同代次的碱基突变没有随传代次数的增加而增高,呈不规律性。丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)中B细胞抗原表位区中碱基最高突变率为0.98%(V3代次T6449G位点),其他代次均0.8%;全基因组各代次位点最高突变率为V3代次C7323G,突变率为9.89%;其余代次突变率均9.89%,且不在抗原表位区,同一个位点不同代次的碱基突变没有随传代次数的增加而增高,呈不规律性。PT的ELISA比活性平均值为0.532±0.100,最低限值为0.232。PRN的ELISA比活性平均值为0.885±0.110,最低限值为0.555。FHA的ELISA比活性平均值为0.701±0.170,最低限值为0.191,百日咳菌种抗原含量和比活性较稳定。结论传代过程中PT、PRN、FHA主要碱基位点突变率较低,说明百日咳菌种基因遗传稳定性好。     

紫外线和60Coγ射线对钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的诱变效应

将对数期的钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)(原名钝顶螺旋藻,Spirulina platensis)A9菌株用超声波40 s预处理破碎成2个~4个细胞大小的片断,分别用不同剂量的紫外线(UV)和60Coγ射线处理,诱变后经3小时避光预培养分别接种于液体和固体培养基进行培养。固体培养时UV照射70 s和60Coγ照射3 500 Gy后无菌体存活,而在液体培养中高剂量处理的样品可以部分恢复生长。将诱变后的菌液分别加入20μg.mL-1的ρ-氟苯丙氨酸(-ρfluorophenylalan ine,FPA)和20μg.mL-1的刀豆氨酸(L-canavan ine su lphate,CS),放入光照培养箱中预培养3 d~4 d后涂于含相同浓度的氨基酸类似物FPA和CS平板,培养30 d后计算抗氨基酸类似物突变株的突变率。UV对A9菌株的完全致死剂量LD和存活率37%时的剂量D37值分别为70 s和22 s,LD/D37=3.18。A9菌株经UV诱变25 s时存活率为28.7%,抗FPA和抗CS突变率分别为2.31×10-3和1.50×10-3,最大诱变效应比(MME)分别为48.53和52.63。60Coγ射线对A9菌株的LD和D37值分别为3 500 Gy、1 250 Gy,LD/D37=2.8。60Coγ射线显著提高A9菌株的突变率,当诱变剂量为2 000 Gy、存活率为10.49%时A9菌株突变率最高,抗FPA和抗CS突变率分别为5.07×10-3和0.964×10-3,最大诱变效应比(MME)分别为241.43和74.15。60Coγ射线对钝顶节旋藻A9菌株的损伤比UV造成的损伤强烈(低的LD/D37值),比UV具有较大的诱变效应(高MME值)。采用两种诱变剂获得的抗FPA突变率都要高于抗CS突变率。通过诱变获得了大量的抗氨基酸类似物突变株,为遗传重组研究提供携带重要遗传标记的材料。     

鸡MC4R基因的SNPs及其与屠体性状的相关研究

黑素皮质素受体(MC4R, melanocortin-4 receptor)基因的突变与猪、鼠和人等的食欲、肥胖、生长等性状有关, 而鸡MC4R基因的功能却知之甚少. 利用PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)和DNA测序的方法, 对资源家系F₂代鸡群MC4R基因多态性进行了分析, 发现存在4个单核苷酸多态(SNPs, single nucleotide polymorphisms)位点. 其中, 在MC4R基因5′调控区-524 nt发生了碱基的转换突变(C→T), 导致突变型基因比野生型基因多了一个NF-E2和一个cap转录因子结合位点; 在MC4R编码区(61 nt)发生了碱基的错义突变(G→A), 导致此处蛋白质的氨基酸由甘氨酸变为精氨酸; 在MC4R编码区315和336 nt发生了碱基的颠换突变(G→T)和转换突变(C→T), 这两个突变为同义突变. 通过最小二乘分析SNPs与屠体性状的关系, 结果是突变的BB, DD和FF等基因型与鸡的体重、全净膛重(或半净膛重)、腿肉重等存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的关系, 但与腹脂重不显著. 结果表明, MC4R基因可以作为影响和控制鸡体重、生长等屠体性状的主要候选基因.     

胞质异质性——人类肿瘤组织线粒体基因突变的普遍现象

为了探讨不同肿瘤组织中线粒体基因体细胞性突变的胞质异质性和同质性状态,利用32对重叠引物对149例肿瘤组织和匹配的正常组织的全线粒体基因进行PCR扩增,并同时进行时相温度梯度凝胶电泳扫描突变筛选,基因测序确定突变类型与异质状况。结果表明,不同肿瘤组织中线粒体基因体细胞性突变的异质率不同,口腔癌（65%）和食道癌（64%）具有较高的异质率,其次为乳腺癌（45.9%）。4种转换形式的发生频率Hm→Hm > Hm→Ht > Ht→Hm > Ht→Ht。碱基转换的主要转换形式为Hm→Hm,碱基颠换则以Hm→Ht。认为胞质异质性是人类肿瘤组织线粒体基因突变的普遍现象。Abstract: To explore the status of heteroplasmy and homoplasmy of Mitochondrial DNA somatic mutations in different tumors. DNA from 149 tumors and corresponding normal tissues were extracted and entire mitochondrial genome was amplified using 32 pairs of overlapping primers. The somatic mutations were screened by temporal temperature gradient gel electrophoresis and their heteroplasmic statute were identified by sequencing. The results showed that the incidence rate of heteroplasmy of mitochondrial DNA somatic mutations varies in different tumors. There is a high rate of heteroplasmic mutation in oral cancer (65%) and esophageal cancer (64%), followed by breast cancer (45%). The frequency of four transfer types is Hm (homoplasmy)→Hm (heteroplasmy) > Hm→Ht > Ht→Hm > Ht→Ht. The main transfer forms of transition and transversion mutations are Hm→Hm and Hm→Ht respectively. Heteroplasmy is a common phenomenon in mitochondrial DNA somatic mutations of human tumors.     

牛FSHR基因第10外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系

以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为实验材料 ,以牛的FSHR基因的第 10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因 ,用SNP法进行了多态检测 .结果发现 ,在秦川牛的双胎母牛中突变率 6 0 % (6 10 ) ,而在单胎母牛中突变率为 2 0 % (2 10 ) ;在荷斯坦奶牛中 ,双胎母牛突变率为31 2 5 % (5 16 ) ,单胎母牛突变率为 6 6 7% (1 15 ) ;由此可见双胎牛和单胎牛二者之间FSHR基因的第 10个外显子的突变率差异明显 .这表明 ,选择FSHR基因的第 10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因 .序列分析发现 ,在FSHR基因的第 15 0 6位碱基发生了突变 (T→C) ,但氨基酸没有发生变化 .     

雌核发育银鲫微卫星突变速率和突变模式

银鲫是天然雌核发育的三倍体两性型种群, 因其遗传背景和生殖方式的特殊性, 已经成为研究单性和多倍体脊椎动物进化遗传学的理想模式鱼类。利用33个微卫星序列对雌核发育银鲫的突变速率和突变模式进行研究, 结果表明: (1) 22个子代个体中, 检测到1尾个体在15个微卫星位点具有18个突变等位基因; (2) 每个微卫星位点每代总体平均突变率是1.16×10-2, 95%置信区间是6.87×10-3~1.83×10-2, 与其他鱼类相比, 雌核发育银鲫的突变率明显偏高, 这与天然雌核发育鱼类处在单性生殖和两性生殖的过度阶段有密切关系; (3) 具有突变等位基因的13个位点的重复单元数目都在10次以上, 11个复合型微卫星位点的突变率(1.31×10-2)与21个完美型位点(1.00×10-2)的突变率没有明显差异(P = 0.67), 微卫星突变率受到重复单元数目的影响, 然而与重复结构类型和侧翼序列GC碱基含量无相关性; (4) 序列分析表明, 雌核发育银鲫的微卫星突变模式并不严格遵守逐步突变模型。     

HLA-B*2736等位基因的序列分析

使用FLOW-SSO、PCR-SSP以及测序等分型技术, 发现一个与HLA-B*270401基因相关的未知基因。设计基因特异性引物单独扩增B*27基因的外显子2-5, 包括内含子2-4, 并进行双向测序, 分析与B*270401基因序列的差异。该基因的扩增产物为1 815 bp。与B*270401相比在外显子3和4共有10个碱基的改变, 从而使相应氨基酸发生错义或同义突变。碱基634 A→C (密码子130丝氨酸→精氨酸); 670 A→T (密码子142苏氨酸→丝氨酸); 683 G→T (密码子146色氨酸→亮氨酸); 698 A→T (密码子151谷氨酸→缬氨酸); 774 G→C (密码子176谷氨酸→天冬氨酸); 776 C→A (密码子177苏氨酸→赖氨酸); 781 C→G (密码子179谷氨酰胺→谷氨酸); 789 G→T (密码子181丙氨酸同义突变); 1 438 C→T (密码子206甘氨酸同义突变); 1 449 G→C (密码子210甘氨酸→丙氨酸)。在IMGT/HLA数据库中B*27组只有3个基因（B*270502 / 2706 / 2732）提交了内含子序列。该未知基因的内含子2序列与B*2706相同, 显示了与B*27组基因的同源性, 但其同源性在内含子3、4均未得到支持, 与B*27组基因相比, 内含子3的第106个碱基C→G, 碱基168缺失, 碱基179 G→A, 碱基536 G→A; 内含子4中碱基82 T→C。但其内含子3、4序列却与B*070201完全相同。该基因序列已提交GenBank, 编号为被DQ915176, 被WHO确认为HLA-B*2736等位基因。     

深圳地区结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变分布

目的:调查深圳地区结核分枝杆菌耐利福平(RFP)株rpoB基因突变的分布情况,建立结核分枝杆菌耐药基因快速检测的方法.方法:对55株结核分枝杆菌临床分离株的rpoB基因280个碱基(包括其核心区75个碱基)应用PCR-直接测序法(PCR-DS)测定序列,其中耐利福平株51株,敏感株4株.结果:4株敏感株无突变,92.2%(47/51)耐利福平临床分离株存在rpoB基因突变.基因突变导致531位氨基酸突变率为41.2%(21/51);导致526位氨基酸突变率为29.4%(15/51);导致516位氨基酸突变率为13.7%(7/51).联合突变发生率为2.0%(1/51).未检测到发生缺失或插入碱基突变的菌株.结论:深圳地区结核分枝杆菌耐利福平株发生rpoB基因突变最常见的是531位丝氨酸、526位组氨酸和516位天冬氨酸的基因突变,三者突变率之和为84.3%(43/51).PCR-DS方法可快速测定结核分枝杆菌RFP耐药基因突变.     

我国登革3型病毒广西80-2株基因组全序列分析

对我国登革 3型病毒 80 2株基因组进行全序列测定 ,为了解其基因组结构与功能的关系提供依据 .根据登革 3型病毒H87株的序列设计并合成引物 ,应用RT PCR和RACE法 ,对 80 2株基因组RNA进行扩增、克隆测序后获得我国登革 3型病毒广西株基因组序列 .该株病毒基因组全长10 696nt ,不含poly(A)尾 ,4种碱基数分别为A :3 4 3 7,C :2 2 15,G :2 773 ,U :2 2 71.包含一个读码框架 ,自 95至 10 2 67位 ,共 10 170个碱基 ,编码 3 3 90个氨基酸 ,5′和 3′非编码区长度分别为 94nt和4 3 2nt.与H 87株比较 ,核苷酸和氨基酸序列同源性均在 99%以上 ,有 2 8个碱基发生改变 ,其中 2 6个碱基突变发生在读码框架内 ,碱基转换 18个 ,颠换 10个 ;碱基突变引起 14个氨基酸的改变 .80 2株与H87株病毒的基因组全序列同源性高 ,变异度小 .     

nut R 中的突变对λ噬菌体早期转录抗终止作用的影响

将λDNA的nutR序列置于Lac启动子的下游,在nut R和β-半乳糖苷酶基因(gal K)之间插入λ噬菌体依赖rho的终止子tR1,使ga1 K的表达取决于N蛋白介导的转录抗终止作用。为研究nutR对抗终止的影响,系统地进行了该序列中每个碱基的点突变(A→C,G→T,C→A及T→G)。结果表明boxA中有两个碱基(位置2和5)的突变对抗终止作用是至关重要的,使抗终止效率降低了10倍;而其他位置的改变影响甚微。boxA的缺失在nus~ 宿主中使抗终止效率降低了40％,但在nusB宿主中却恢复到野生型水平。boxB茎环结构中,茎部顶端的碱基对及环中邻近基部的两个碱基的突变对抗终止作用影响很大,被认为是N蛋白的识别序列。boxA和boxB之间的间隔序列中有两个碱基的突变几乎使抗终止作用丧失。     

奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区PCR-SSCP多态性分析

采用PCR-SSCP技术,对奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区1122bp序列进行多态性分析.在该区所划分的5个亚片段上,发现Blf 5′-1(227bp),Blf 5′-3(175bp)和Blf 5′-5(293bp)3个DNA片段存在多态.进一步对这3个片段进行测序分析,在Blf 5′-1序列中,发现位于转录起始位点上游-926和-915位分别有G→A及T→G点突变;在Blf 5′-3片段中,-478位存在G的插入;Blf 5′-5位点上,发生-28位的C颠换为A和 33位的G颠换为C两处突变.利用TFSEARCH (ver.1.3)软件对乳铁蛋白基因5′侧翼区潜在调控元件及蛋白质结合位点进行了预测,结果显示5′侧翼区的突变引起了蛋白质结合因子的变化.     

应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术。本课题组在前期工作中利用该系统在毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中率先实现了对内源基因—八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的定点敲除。为研究靶点的设计和选择对该系统介导的杨树内源基因敲除效率的影响,本文分析了不同单向导RNA(Single-guide RNA, sgRNA)结合毛白杨PDS(PtPDS)靶基因DNA序列后对突变效率的影响。结果发现sgRNA与靶基因间的碱基错配会导致突变的效率降低,甚至不能突变,其中3′端的碱基配对更为重要。进一步测序分析发现,该系统能同时敲除杨树基因组上两个同源的PDS编码基因(PtPDS1和PtPDS2),突变率分别达86.4%和50%。研究证明该系统可快速高效地敲除两个以上的内源基因,获得多重突变体杨树株系。利用该技术,本课题组已获得多个杨树转录因子及结构基因的敲除突变体株系,为将来开展基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础。